海南省火龙果软腐病病原菌的鉴定及生物学特性

郑樊 徐刚 仇芳 郑妃庆 郑丽 谢昌平

摘要 红皮深红肉火龙果软腐病主要发生在花瓣、鳞片和果实。采用组织分离法分离病原菌，通过琼脂平板稀释纯化、致病性测定、形态学和分子生物学方法将病原鉴定为桃吉尔霉Gilbertella persicaria。生物学测定结果表明：该病原菌在15～37℃范围内均能生长，低于10℃不能生长，最适温度32℃;最适pH 5.0～6.0;连续光照更有利于菌丝生长。

关键词 红皮深红肉火龙果; 软腐病; 病原鉴定; 桃吉尔霉; 生物学特性

中图分类号： S 436.67

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018347

火龙果Hylocereus spp.又名红龙果、情人果和仙蜜果等，因外表肉质鳞片似龙鳞而得名，原产于墨西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区，现在我国海南、福建、广东、广西、贵州和云南等省（自治区）均有种植。大部分火龙果属于仙人掌科，量天尺属Hylocereus （Berger） Britton et Rose，其他则属于蛇鞭柱属Selenicereus Britton et Rose[1]。火龙果主要有三种商业种类：红皮白肉火龙果Hylocereus undatus、红皮红肉火龙果H.polyrhizus和红皮深红肉火龙果H.costaricensis[2]。火龙果集水果、蔬菜、花卉于一体，营养丰富，深受消费者青睐，具有广阔的发展前景。

目前，国内外记载的火龙果病害有由Enterobacter cloacae[3]、Fusarium oxysporum和F.dimerum[4]、Erwinia sp.[5]引起的软腐病，由F.oxysporum[5]引起的枯萎病，由Paenibacillus polymyxa[6]、Bipolaris cactivora[7]、F.semitectum、F.oxysporum和F.moniliforme[8]引起的莖腐病，Rhizopus stolonifer[9]引起的根霉病，由Botryodiplodia theobromae[8]引起的焦腐病，由Bipolaris cactivora、Scytalidium dimidiatum[8]、Fusarium spp.[10]、Gilbertella persicaria[1112]和F.dimerum[13]引起的果腐病，由Neoscytalidium dimidiatum[1415]引起的溃疡病或褐斑病，由Colletotrichum gloeosporioides、C. truncatum[16] 和C.capsici[8]引起的炭疽病，Bipolaris cactivora[17]引起的黑斑病，由Phoma sp.、Diplodia sp.、Ascochyta sp.[18]引起的茎枯病，Cactus virus X[19]引起的病毒病，由Septogloeum sp.[20] 引起的茎斑病以及由Scytalidium dimidiatum[21]、Bipolaris cactivora[22]、F.lateritium、Aspergillus niger和A.flavus[23]引起的腐烂病等。

2016年，笔者在海南省昌江县的火龙果种植基地发现一种危害红皮深红肉火龙果花瓣、鳞片和果实的软腐病，发病部位初期产生水渍状的病斑，病部覆盖一层灰白色的霉层，严重时病斑扩大至全部花瓣、鳞片和果实，造成病部呈软腐状，严重影响其产量，而且在果实贮藏过程中该病引起成熟果实的大量腐烂变质。本研究通过对红皮深红肉火龙果软腐病的病原菌进行分离培养、纯化、致病性测定、病原鉴定和生物学特性的研究，旨在弄清病原分类地位，掌握该病发病规律，从而为该病害的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

感病的红皮深红肉火龙果于2017年4月采自海南省昌江县某火龙果种植基地。

1.2 症状描述

按常规方法对田间发病典型部位出现的症状进行描述，并拍摄病害的症状。

1.3 菌株的分离及纯化

采用常规组织分离法[24]对病原菌进行分离，采用琼脂平板稀释纯化法[25]进行纯化，并将纯化菌株转入试管斜面于4℃保存。

1.4 致病性测定

将保存的菌株于PDA培养基上25℃培养2 d。采用刺伤接种法，在每个果实上刺伤4个点，在刺伤点上接种菌丝块，以接种无菌PDA培养基为对照，试验重复3次，用灭菌脱脂棉蘸取无菌水进行保湿，24 h后移去脱脂棉，在常温25℃下，观察发病情况。若接种果实发病则取发病部位再分离，完成柯赫氏法则验证。

1.5 病原菌鉴定

1.5.1 形态学鉴定

将病原菌接种于PDA培养基上，25℃全光照下培养2～3 d，观察、记录菌株的菌落形状和颜色、病原菌孢子的形状，测量孢子大小，并拍照。

1.5.2 病原菌DNA的提取及分子生物学鉴定

将供试病原菌接种于PDA上，25℃全光照下培养2～3 d，用无菌药匙刮取菌丝体置于1.5 mL无菌离心管中，按照Fungal DNA Kit真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（OMEGA BIO-TEK）说明，提取基因组DNA。PCR扩增试剂盒2×Es Taq Master Mix、扩增引物购自生工生物工程股份有限公司。

分别采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′）和LROR（5′-ACCCGCTGAACTTAA-GC-3′）/LR7（5′-TACTACCACCAAGATCT-3′）对序列进行扩增。PCR反应体系（50 μL）：DNA模板 2 μL，上下游引物各2 μL（10 μmol/L），2×Es Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。ITS扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃ 退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环;最后72℃延伸10 min。LSU扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环;最后72℃延伸7 min，4℃保存。

用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。PCR产物委托华大基因（深圳）股份有限公司纯化和测序。测序结果在GenBank中进行BLAST，并下载相关序列，用MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统发育树。

1.6 病原菌生物学特性

1.6.1 温度对病原菌菌丝生长的影响

将直径为5.0 mm的菌饼接于PDA培养基平板中央，分别置于15、20、25、28、30、32、35、37和40℃共9个不同温度的培养箱中黑暗培养。每处理重复3次。48 h后用十字交叉法测量菌落直径。

1.6.2 pH对病原菌菌丝生长的影响

PDA培养基灭菌以后，无菌条件下用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl溶液调节PDA培养基的pH，将直径为5.0 mm的菌饼分别置于pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的PDA培养基平板上，于32℃恒温培养箱中培养。每处理重复3次。48 h后用十字交叉法测量菌落直径。

1.6.3 光照对病原菌菌丝生长的影响

将直径为5.0 mm的菌饼接于PDA培养基平板中央，分别置于连续光照、L∥D=12 h∥12 h、连续黑暗的32℃恒温培养箱中培养。每处理重复3次。48 h后用十字交叉法测量菌落直径。

2 结果与分析

2.1 症状描述

病害主要危害花瓣、鳞片和果实。田间发病花瓣首先凋萎，初期产生水渍状淡褐色病斑，病斑迅速扩展，造成整个花冠呈软腐状。病害继续从花瓣扩展到鳞片，引起鳞片的软腐，最终导致整个花冠和鳞片的软腐（图1a～b）。幼果发病引起果肉变为暗褐色软腐状（图1c）。果实成熟后病果上出现水渍状病斑，病斑迅速扩大，1～2 d病斑扩大至全果实，果实呈软腐状。受危害的花瓣、鱗片和果实在后期均产生大量的白色至灰褐色霉层和黑褐色的球形孢子囊（图1d～f）。病害多发生在开花期，发病率为15%。发病率与花剪除及时与否有关，花剪除及时，可降低发病率。贮藏期发病多是由采摘造成的机械损伤或溃疡病造成的伤口侵染引起。

2.2 病原菌的致病性测定

对健康的红皮深红肉火龙果果实进行接种，以无菌的PDA为对照，5 d后针刺伤接种的果实全部发病，接种产生的症状与田间发病的症状相同（图1g～h），而对照果实不发病（图1i）。对发病组织进行再分离，可得到与原分离株相同的病原菌，符合柯赫氏法则，证明接种菌为火龙果软腐病的致病菌。

2.3 病原菌的培养性状及形态

在PDA上菌落圆形扩展，菌丝浓密（图2a），气生菌丝发达，无隔膜。孢囊梗暗褐色至浅褐色;多数直立，少数弯曲;1～2个分枝，多数为1个分枝。顶端产生1个孢子囊，球形，黑褐色，直径90.00～133.81 μm， 平均110.57 μm。无假根和匍匐菌丝。囊轴球形，无色，直径为47.30～73.04 μm， 平均65.12 μm（图2b～d）。孢囊孢子浅褐色至褐色，短椭圆形或球形，球形孢囊孢子直径6.38～10.03 μm， 平均8.21 μm，短椭圆形孢囊孢子大小为（6.01～11.25）μm×（5.28～9.42）μm， 平均8.61 μm×7.65 μm（图2e）。根据病原菌的培养特性和形态特征，初步鉴定为接合菌门、接合菌纲、毛霉目、吉尔霉属、桃吉尔霉Gilbertella persicaria。

2.4 火龙果软腐病病原系统发育分析

通过ITS和LSU 2对引物对菌株进行PCR扩增、测序，得到长度分别为611 bp和1 075 bp的序列（GenBank登录号分别为：MH568797和MH578264）。将得到的序列在GenBank中进行比对，并对2个基因序列联合构建系统发育树，经MEGA 6.0 软件进行系统发育分析，系统发育树的各个分支的支持强度通过1 000次重复的自展检验数值进行评估。结果发现，菌株HLGRF与Gilbertella persicaria聚为一个进化支（图3），支持率为100%。依据形态鉴定和系统发育分析，将火龙果软腐病病原菌鉴定为桃吉尔霉G.persicaria。

2.5 病原菌的生物学特性

2.5.1 温度对病原菌菌丝生长的影响

病原菌对温度的适应范围很广，在15～37℃范围内均能生长。在10～32℃范围内随温度的升高，菌落直径随之增大;在32～40℃范围内，菌丝生长随温度升高呈下降趋势;菌丝生长的最适温度为32℃，2 d后菌落直径达79.0 mm，极显著高于其他温度下的菌落直径。温度低于10℃或高于40℃，菌丝不能生长（图4）。

2.5.2 pH对病原菌菌丝生长的影响

病原菌菌丝在pH 3.0～11.0均能生长。在pH为3.0～5.0时，菌丝生长速率逐渐增快，在pH 5.0～6.0时，菌丝边缘齐整，气生菌丝发达，菌落大小差异不显著，pH为5.0时菌落最大，直径为67.8 mm最适pH为5.0。在pH为5.0～11.0范围内，随着pH升高，菌丝生长速率逐渐下降（图5）。

2.5.3 光照对病原菌菌丝生长的影响

病原菌在不同光照条件下均可生长，在不同条件下，菌落直径存在显著差异，在连续光照条件下菌落扩展最快，直径为79.5 mm，其次是光暗交替条件，连续光照条件最有利于菌丝生长（图6）。

3 结论与讨论

通过病害田间症状观察、致病性测定、病原菌形态学及分子生物学鉴定，将引起海南红皮深红肉火龙果软腐病病原确定为桃吉尔霉G.persicaria。火龙果的腐烂病害大部分由镰孢属引起[26]，对桃吉尔霉引起的腐烂病害报道较少，有云南郭力维等[11]报道的火龙果果腐病，广西林珊宇等[27]报道的火龙果软腐病，而目前海南对桃吉尔霉属引起的软腐病并未见报道。该病菌在国外报道还可侵染海南蒲桃[28]、桃[29]、茄子[30]、番木瓜[31]和番茄[32]等，甚至可侵染虾[33]。

本研究由桃吉尔霉引起的红皮深红肉火龙果软腐病与已经报道的匍枝根霉Rhizopus stolonifer引起的软腐病[34]在症状上难以区别，但是病原菌形态明显不同于匍枝根霉，匍枝根霉能产生假根和匍匐菌丝，孢囊梗不分枝和不弯曲，而桃吉尔霉不能产生假根和匍匐菌丝，孢囊梗多数1～2个分枝，个别孢囊梗顶端弯曲。

本文较为系统地研究了温度、pH和光照对病原菌生长的影响，结果表明，该病原菌最适生长温度为32℃，而据郭力维等[11]报道，该菌的最适温度为30℃，本研究材料来自田间发病果实，郭力维等的材料来自市场上的火龙果，并且郭力维等没有设置32℃的温度;连续光照更有利于菌丝生长;最适pH为5.0～6.0。桃吉尔霉为一种弱寄生菌，病原菌只能通过伤口侵入，因此，在采收、贮运过程中应减少机械损伤;根据生物学特性，该菌在10℃下不生长，贮存温度应低于10℃。同时，该病原菌常在土壤中有机质或果园周围腐败植物病残体上或火龙果腐败的花瓣上存活，因此，该病害的防治措施主要是搞好田间卫生工作，及时清理植物病残体，同时，在火龙果开花后3～4 d应及时剪除腐败的花瓣，以减少病原菌的侵染来源。本研究明确了桃吉尔霉菌丝生长最适条件，为掌握病害发生发展规律，从而防治红皮深红肉火龙果软腐病奠定了基础。

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