内质网应激对大鼠肝星状细胞HSC-T6活化的影响

史晓燕,范 妤,段丽芳,闫曙光,李京涛,席 奇

(1陕西中医药大学基础医学院生物化学教研室,咸阳 712046;2陕西中医药大学附属医院肝病科;*通讯作者,E-mail:biosalome@163.com)

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞内非常重要的细胞器,其功能涉及蛋白质合成、加工、修饰、折叠和运输,Ca2+平衡的维持,脂类和糖类代谢等一系列重要的生物学过程[1]。在某些情况下,当内质网的生理功能发生紊乱时会启动一定应激机制,即内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),促进细胞存活。但若应激持续存在,细胞将启动凋亡程序[2,3]。细胞凋亡对肝纤维化的影响包括两个方面,一方面肝细胞的凋亡促进肝纤维化的发生发展,另一方面活化肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的凋亡促进肝纤维化的逆转[4]。有研究表明,ERS在肝纤维化发生发展中发挥重要作用,而肝纤维化发生发展的核心环节为肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化[5]。本实验拟利用衣霉素(tunicamycin,Tun)处理大鼠肝星状细胞HSC-T6,检测ERS相关基因的表达,以确定HSC-T6是否处于ERS状态,通过对HSC-T6内纤维化相关基因和TGF-β1/Smad信号通路相关基因进行检测,进一步探讨ERS对HSC-T6活化的影响及其可能涉及的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和处理

大鼠肝星状细胞HSC-T6(购自北纳生物)培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基中,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。Tun处理前传代到6孔板或24孔板中,当细胞密度达到70%-80%时,加入终浓度为0,0.1,0.5,1.0,2.0和4.0 μg/ml(0 μg/ml为空白对照组)的Tun处理24 h。

1.2 主要试剂

DMEM细胞培养基、胰酶购自美国GIBCO公司;胎牛血清购自以色列Biological Industries公司;RNAiso Plus(货号9108)、PrimeScript RT Master Mix(货号RR036A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(货号RR820A)购自日本TaKaRa公司;蛋白提取、定量及Western blot相关试剂购自武汉博士德生物工程有限公司;Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets(货号A32959)购自美国Thermo Fisher Scientific;anti-α-SMA、anti-β-Actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;anti-CHOP抗体购自美国Santa Cruz公司;anti-GRP78抗体、anti-Smad4抗体购自美国Cell Signal Technology;real-time PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 主要仪器

细胞培养板(Costar公司);CO2细胞培养箱(Thermo Scientific);台式高速冷冻离心机(eppendorf);BCD-579WE低温冰箱(青岛海尔股份有限公司);蛋白电泳系统(Bio-Rad公司);全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司);7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems);全自动凝胶成像系统(美国Protein Simple公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 RNA的提取及反转录 利用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA。24孔板每孔加500 μl RNAiso Plus处理细胞,待其完全裂解后将液体转移至1.5 ml无RNA酶的离心管中室温放置5-10 min;加入100 μl氯仿至裂解液中,震荡混匀,室温静置15 min;4 ℃,12 000g离心15 min,离心后的液体分为三层,小心吸取上层水相至一个新1.5 ml无RNA酶的离心管中;按照每1 ml Trizol加500 μl异丙醇的比例,再加入250 μl异丙醇轻轻颠倒混匀;室温静置30 min,4 ℃,12 000g离心10 min;小心吸取去掉上清,加入20 μl无RNA酶水溶解RNA备反转录用。以总RNA为模板,经PrimeScript RT Master Mix反转录获得cDNA。

1.4.2 蛋白提取及定量 弃6孔板内的细胞培养液,用适量预冷的PBS缓冲液冲洗细胞;加入1 ml预冷的PBS缓冲液,用细胞刮将细胞刮下并转移至离心管中,4 ℃,3 000g离心5 min;弃上清,加入添加有Protease and Phosphatase Inhibitor的RIPA裂解液150 μl,冰上孵育2 h;4 ℃,12 000g离心10 min,吸取上清,BCA法进行蛋白定量。

1.4.3 real-time PCR检测 以反转录得到的cDNA为模板,按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行Real-time PCR检测。以β-actin作为内参,采用2-ΔΔCt的方法对Grp78、CHOP、α-SMA、TIMP1、Col1a1、TGF-β1进行相对定量。各基因引物序列见表1。

1.4.4 Western blot检测 加等量的蛋白样品进行SDS-PAGE,经电转将蛋白样品转至PVDF膜,用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h。分别加抗β-actin(1 ∶1 000)、抗CHOP(1 ∶200)、抗α-SMA(1 ∶200)、抗GRP78(1 ∶1 000)、抗Smad4(1 ∶1 000)的一抗,4 ℃摇摆摇床上孵育过夜,TBST漂洗3次,每次5 min。加HRP标记的二抗(山羊抗小鼠IgG 1 ∶1 000或山羊抗兔IgG 1 ∶5 000),室温在摇摆摇床上孵育1 h,TBST漂洗3次,每次5 min。加ECL发光液,利用凝胶成像系统,选择合适的曝光时间拍照。

表1 Real-time PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for real-time PCR

基因名称引物序列(5′-3′) Grp78上游引物:GGGACAGGAAACAAAAACAAAATC下游引物:TCTCGGCGTCATTGACCATCHOP上游引物:AGCTGGAAGCCTGGTATGAG下游引物:GACCACTCTGTTTCCGTTTCα-SMA上游引物:AGAAGCCCAGCCAGTCGCCATCA下游引物:AGCAAAGCCCGCCTTACAGAGCCTIMP1上游引物:CAGCAAAAGGCCTTCGTAAAGA下游引物:GATCTGATCTGTCCACAAGCAATGCol1a1上游引物:CTGCATACACAATGGCCTAA下游引物:GGGTCCCTCGACTCCTATGF-β1上游引物:TTGCCCTCTACAACCAACACAA下游引物:GGCTTGCGACCCACGTAGTAβ-actin上游引物:TGTACGTAGCCATCCAGGCT下游引物:TTCTCCAGGGAGGAAGAGGA

1.5 统计分析

2 结果

2.1 RNA提取结果

总RNA提取完成后利用紫外分光光度计测定其浓度,测定结果显示各样品RNA的浓度位于350-700 ng/μl之间,其OD260/OD280比值均位于1.90-2.00之间,可用于后续反转录和real-time PCR定量。

2.2 蛋白提取及定量结果

利用BCA定量法测得标准品特定浓度对应的OD值,据此作出标准曲线(见图1),并根据所提取蛋白样品的稀释比例及测得的OD值计算各样品的蛋白浓度。在各样品中加入稀释液及上样缓冲液,以确保各泳道上样蛋白总量相同。将所有样品的蛋白浓度调到1.50 μg/μl,SDS-PAGE蛋白电泳时各取15 μl上样,以确保各泳道上样蛋白总量相同。

图1 BCA蛋白定量标准曲线Figure 1 Standard curve of BCA protein quantitative

2.3 内质网应激HSC-T6细胞模型的建立

real-time PCR结果表明,Tun处理后内质网应激相关基因Grp78和CHOP在mRNA转录水平均上调,其中Grp78上调10倍以上(见图2),CHOP上调30倍以上(见图2),差异具有显著性(P<0.01)。Western blot检测得到了相同的结果(见图3),未用Tun处理的HSC-T6细胞内几乎不表达Grp78和CHOP蛋白,但是用Tun处理后HSC-T6细胞内Grp78和CHOP蛋白的表达量显著上调。

与空白对照(0 μg/ml)组比较,**P<0.01;β-actin为内参基因图2 real-time PCR检测Tun处理后Grp78和CHOP在mRNA水平的改变Figure 2 Detection of the transcription level of Grp78 and CHOP after tunicamycin treatment by real-time PCR

图3 Western blot检测Tun处理后Grp78和CHOP在蛋白水平的改变Figure 3 Detection of the protein expression level of Grp78 and CHOP after tunicamycin treatment by Western blot

2.4 内质网应激对HSC-T6纤维化相关基因表达的影响

real-time PCR检测结果表明,与空白对照组相比,肝纤维化相关基因α-SMA和TIMP1的转录水平在Tun浓度为2.0 μg/ml时上调幅度最大(P<0.01,见图4)。但是,Col1A1的转录水平在HSC-T6细胞中加入Tun处理后却显著降低(P<0.01,见图4)。Western Blot检测结果显示,肝纤维化标志蛋白α-SMA的表达水平在Tun处理浓度为1.0 μg/ml时显著增加,在Tun浓度为2.0 μg/ml时上调最显著(P<0.05，见图5)。

与空白对照(0 μg/ml)组比较,*P<0.05,**P<0.01;β-actin为内参基因图4 real-time PCR检测Tun处理后α-SMA、TIMP1和Col1A1在mRNA水平的改变Figure 4 Detection of the transcription level of α-SMA, TIMP1 and Cal1A1 after tunicamycin treatment by real-time PCR

与空白对照(0 μg/ml)组比较,*P<0.05,**P<0.01;β-actin为内参基因图5 Western blot检测Tun处理后α-SMA在蛋白水平的改变Figure 5 Detection of the protein expression level of α-SMA after tunicamycin treatment by Western blot

2.5 内质网应激对HSC-T6内TGF-β/Smad信号通路相关基因表达的影响

real-time PCR检测结果表明,TGF-β1的转录水平在Tun浓度为1.0 μg/ml时显著上调,之后随浓度的升高而增加(P<0.05,见图6)。Western Blot检测发现,TGF-β1/Smad通路中协同型Smad-Smad4的表达水平随着Tun浓度的增加而增加,在Tun浓度为2.0 μg/ml时表达量最高(P<0.05,见图7)。

与空白对照(0 μg/ml)组比较,*P<0.05,**P<0.01;β-actin为内参基因图6 real-time PCR检测Tun处理后TGF-β1在mRNA水平的改变Figure 6 Detection of the transcription level of TGF-β1 after tunicamycin treatment by real-time PCR

与空白对照(0 μg/ml)组比较,*P<0.05,**P<0.01;β-actin为内参基因图7 Western blot检测Tun处理后Smad4在蛋白水平的改变Figure 7 Detection of the protein expression level of Smad4 after tunicamycin treatment by Western blot

3 讨论

肝纤维化是各种急慢性肝损伤导致的肝脏纤维生成和炎症反应的过程,如不及时治疗可能发展成为肝硬化甚至肝癌,严重影响人类的生活质量[6,7]。肝纤维化发生发展的核心环节是HSC的活化,HSC活化过程伴随大量炎性因子和趋化因子的分泌,胶原蛋白、基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinases 1,MMP1)、TIMP1等细胞外基质的表达异常,α-SMA、波形蛋白及结蛋白等纤维细胞相关蛋白的表达,最终导致肝纤维化的发生[5,8,9]。

HSC的活化受多种细胞因子的刺激,从而激活多条信号通路,如TGF-β1/Smad、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、Wnt/β-catenin、NF-κB途径等,其中TGF-β1/Smad通路是调控肝星状细胞活化的关键[10-13]。此外,近年来的研究表明,ERS在肝纤维化的发生发展和逆转中起了重要的作用,不仅能够诱导肝细胞的凋亡或HSC的活化而促进肝纤维化的发生发展,而且能诱导HSC的凋亡而促进肝纤维化的逆转[14-16]。那么,ERS是否通过干预TGF-β1/Smad通路促进HSC活化呢?

研究表明,Tun处理可引起细胞的内质网应激反应,故本研究采用不同浓度Tun处理大鼠肝星状细胞HSC-T6建立HSC的ERS模型,并通过检测ERS相关基因Grp78和CHOP的表达以确保模型的成功建立[17,18]。real-time PCR和Western blot结果表明,Tun处理后Grp78和CHOP在mRNA和蛋白水平均显著升高,因此我们认为在HSC-T6细胞内加入适当浓度的Tun能够成功建立HSC-T6细胞ESR模型。

随后,我们检测肝纤维化及TGF-β1/Smad信号通路相关基因的表达,以探索内质网应激作用对HSC活化的影响及可能机制。real-time PCR和Western blot结果表明,ERS能够促进HSC-T6细胞内α-SMA和TIMP1的表达,但对Col1A1的表达却起到抑制作用。α-SMA的异常表达是HSC活化的重要标志,同时HSC的活化促进了TIMP1的表达,使MMPs的活性受到抑制,导致细胞外基质的合成和降解失衡,从而促进肝纤维化的进程[8,9]。ERS对Col1A1表达的抑制可能是由于其调控的是其他信号通路,其机制有待进一步研究。

TGF-β1/Smad通路是调控HSC活化的关键信号通路,因此我们尝试检测内质网应激是否会影响HSC-T6细胞内TGF-β1/Smad信号通路相关基因的表达。结果表明,ERS促进了HSC内TGF-β1/Smad通路中TGF-β1和Smad4的表达,对该通路起到正调控的作用。鉴于TGF-β1/Smad通路在HSC活化中的作用,我们推测ERS可能通过激活TGF-β1/Smad信号通路从而促进HSC活化,其具体调控机制有待深入研究。