miR-26b调控Wnt信号影响子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移和侵袭的实验研究

赵小萌,李 园,王 华,陈 然,代丽丽,王 旭,岳奇芳*

(1石家庄心脑血管医院妇产科,石家庄 050031;2河北医科大学第三医院药剂科;3河北医科大学第一医院妇产科;*通讯作者,E-mail:35906326@qq.com)

子宫内膜癌是常见的发生于女性的恶性肿瘤,是严重影响女性生活质量的关键因素之一,子宫内膜癌具有易复发、易转移等特点,这给子宫内膜癌的治疗带来了巨大挑战[1]。研究显示,子宫内膜癌的发生与microRNA(miRNA)的异常表达有关,miRNA参与调控子宫内膜癌细胞的恶性生长和转移,靶向重建或抑制miRNA的表达是子宫内膜癌治疗的潜在途径[2]。miR-26b是miR-26家族成员,位于2号染色体上,参与糖尿病心肌病、妊娠期糖尿病、神经损伤等相关疾病的发生[3-5]。miR-26b是一个多功能调节因子,其在很多肿瘤组织中表达下调,miR-26b低表达与骨肉瘤、胃癌等肿瘤患者的转移距离呈负相关,miR-26b也可以作为肿瘤患者预后评估的参考指标[6,7]。研究显示,miR-26b在子宫内膜癌中低表达,并且与肿瘤患者的淋巴结转移有关[8]。现阶段对于miR-26b在子宫内膜癌细胞侵袭、迁移中的作用还不明确。研究报道指出Wnt信号在实体肿瘤组织中过度激活,而抑制Wnt信号可以抑制肿瘤的转移和恶性生长[9]。本次实验以子宫内膜癌Ishikawa细胞为体外研究对象,探讨miR-26b在子宫内膜癌细胞侵袭和迁移中的作用和机制,以期为子宫内膜癌的基因靶向治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

子宫内膜癌Ishikawa细胞购自上海晶抗生物工程有限公司;mimics control、miR-26b mimics由苏州吉玛基因股份有限公司合成;TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit购自上海慧颖生物科技有限公司;上皮性钙黏附素(epithelical cadherin,E-cadherin)抗体购自美国Cell Signaling Technology;波形蛋白(vimentin)抗体、c-myc抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology;Wnt信号激活剂氯化锂(LiCl)购自美国Sigma;β-连环蛋白(β-catenin)抗体购自碧云天生物技术有限公司;Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen;Transwell小室购自美国BD;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2 细胞转染和分组

将子宫内膜癌细胞分成Ishikawa组(未经转染的子宫内膜癌细胞)、Ishikawa+miR-NC组(转miR-NC的子宫内膜癌细胞)、Ishikawa+miR-26b组(转染miR-26b mimics的子宫内膜癌细胞),Ishikawa+miR-26b+LiCl组(取转染miR-26b mimics后的子宫内膜癌细胞,使用含有Wnt信号激活剂LiCl浓度为5 mmol/L的细胞培养液培养)。细胞转染使用Lipofectamine2000转染试剂,步骤完全按照试剂盒说明进行,简述如下:子宫内膜癌细胞种植到6孔板,每个孔中添加3×105个细胞(细胞以不含青链霉素的培养液悬浮),放在37 ℃中培养,细胞密度为50%左右时进行细胞转染。把mimics control、miR-26b mimics分别用250 μl的Opti-MEM稀释,充分吹打混合均匀。将5 μl的Lipofectamine 2000添加到250 μl的Opti-MEM中混合,置于室温中结合反应5 min。然后将上述两种稀释液再次混合,放在室温条件下反应20 min,按照每孔添加500 μl至6孔板内。继续培养6 h后,将原上清吸弃,添加新鲜的细胞培养液继续培养。

1.3 real time PCR方法检测miR-20b表达

取Ishikawa、Ishikawa+miR-NC、Ishikawa+miR-26b细胞,继续培养24 h,用Trizol试剂按照常规方法分别提取RNA,使用特异性颈环引物和TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit试剂盒合成cDNA,步骤完全按照试剂盒说明书进行。PCR引物为:miR-20b上游:5′-GAGGACGGAACCGGAAAC-3′,下游:5′-GCTAGTCA TGGTGCAAGA-3′。U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′,下游:5′-ACGCTTCACGAATTTGC-3′。使用SYBR Premix Ex Taq进行real time PCR,U6设置为内参,根据反应的循环阈值(Ct)进行标准化数据分析,计算方法为2-ΔΔCt法。PCR反应程序为:95 ℃ 20 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s。PCR反应体系为:forward和reverse引物(10 nmol/ml)各1 μl、cDNA模板1 μl、SYBR Premix EX Taq 10 μl,添加二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水至20 μl。

1.4 Transwell小室测定癌细胞侵袭和迁移

细胞侵袭实验前将基质胶取出放在4 ℃中融化,然后用RPMI1640按1 ∶10将基质胶稀释,添加到Transwell小室的上室中,在37 ℃孵育5 h。取Ishikawa、Ishikawa+miR-NC、Ishikawa+miR-26b细胞,以0.25%的胰蛋白酶消化以后,将细胞悬浮在不含血清的细胞培养液中。吸取200 μl的细胞悬浮液添加到Transwell小室的上室中,然后在Transwell小室的下室中添加600 μl的细胞培养液,细胞培养24 h,用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤,甲醇固定,添加0.1%的结晶紫染色20 min。在显微镜下观察细胞侵袭数目,随机选择5个视野,计算平均值。细胞迁移实验前不用基质胶包被小室,其余步骤同侵袭实验。

1.5 Western blot法检测E-cadherin、vimentin和Wnt信号关键蛋白β-catenin、c-myc表达

取Ishikawa、Ishikawa+miR-NC、Ishikawa+miR-26b细胞,继续培养24 h,将孔内的上清溶液吸弃,然后添加单去污裂解溶液,放在冰上孵育反应20 min,以12 000 r/min离心10 min,吸取上清,按照BCA蛋白定量试剂盒分别测定蛋白浓度。将蛋白样品加入到1/3体积的4×上样缓冲液中,在100 ℃变性处理5 min,然后添加到聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶上样孔中,每孔按照50 μg上样。先设置50 V电压电泳,观察溴酚蓝快要进入到分离胶时,把电压调高至100 V继续电泳,直至溴酚蓝染料进入到玻璃板的底部。转膜条件设置为:70 V,4 ℃,50 min。转膜结束后取出硝酸纤维素膜(NC膜),经过5%脱脂奶粉在室温中封闭2 h后,再与一抗在4 ℃孵育反应过夜,最后把NC膜放在二抗反应液中孵育2 h。封闭、一抗、二抗孵育后均用TBST(Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween)洗涤3次,每次5 min。用ECL法化学发光。利用Image J扫描内参GAPDH和目的条带的灰度值,分析目的蛋白相对表达水平。E-cadherin、vimentin、β-catenin、c-myc抗体稀释倍数为1 ∶1 000,1 ∶1 000,1 ∶800,1 ∶800。二抗稀释倍数为1 ∶4 000。抗体均用5%脱脂奶粉封闭液稀释。

1.6 Wnt信号激活剂对上调miR-26b影响子宫内膜癌细胞侵袭、迁移的作用

取转染miR-26b mimics后的子宫内膜癌细胞,使用含有Wnt信号激活剂LiCl浓度为5 mmol/L的细胞培养液培养,记为Ishikawa+miR-26b+LiCl。Ishikawa+miR-26b、Ishikawa+miR-26b+LiCl细胞培养24 h,按照上述方法测定细胞侵袭、迁移和细胞中E-cadherin、vimentin、β-catenin、c-myc蛋白表达变化。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 miR-26b mimics上调子宫内膜癌细胞中miR-26b表达水平

Ishikawa+miR-26b组细胞中miR-26b水平高于Ishikawa+miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。miR-26b mimics上调子宫内膜癌细胞中miR-26b表达水平。

2.2 上调miR-26b对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭和E-cadherin、vimentin蛋白表达影响

与Ishikawa+miR-NC组比较,Ishikawa+miR-26b组细胞迁移数目、侵袭数目降低,细胞中E-cadherin蛋白水平升高,vimentin蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图1和表2)。提示,上调miR-26b抑制子宫内膜癌细胞侵袭、迁移和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)。

组别miR-26bIshikawa组1.00±0.08Ishikawa+miR-NC组0.97±0.12Ishikawa+miR-26b组4.15±0.43∗ F146.105 P0.000

与Ishikawa+miR-NC组相比,*P<0.05

图1 Western blot检测miR-26b mimics转染后子宫内膜癌细胞中E-cadherin、vimentin蛋白表达Figure 1 Expression of E-cadherin and vimentin proteins in endometrial cancer cells transfected with miR-26b mimics by Western blot

组别迁移数目侵袭数目E-cadherinvimentinIshikawa组198.65±13.51138.45±10.250.32±0.030.51±0.04Ishikawa+miR-NC组197.26±10.02140.36±11.680.31±0.050.50±0.07Ishikawa+miR-26b组 105.68±9.64∗ 84.65±6.34∗0.64±0.07∗0.24±0.03∗ F67.97531.96038.20528.500 P0.0000.0010.0000.001

与Ishikawa+miR-NC组相比,*P<0.05

2.3 上调miR-26b抑制子宫内膜癌细胞Wnt信号激活

与Ishikawa+miR-NC组比较,Ishikawa+miR-26b组细胞中Wnt信号关键蛋白β-catenin、c-myc水平降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图2和表3)。提示，上调miR-26b抑制子宫内膜癌细胞中Wnt信号激活。

图2 Western blot检测miR-26b mimics转染后子宫内膜癌细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达Figure 2 Expression of beta-catenin and c-myc in endometrial cancer cells transfected with miR-26b mimics by Western blot

组别β-cateninc-mycIshikawa组0.86±0.090.46±0.06Ishikawa+miR-NC组0.88±0.110.47±0.05Ishikawa+miR-26b组0.43±0.05∗0.33±0.03∗ F25.6267.843 P0.0010.021

与Ishikawa+miR-NC组相比,*P<0.05

2.4 Wnt信号激活剂促进上调miR-26b的子宫内膜癌细胞中Wnt信号激活

与Ishikawa+miR-26b组比较,Ishikawa+miR-26b+LiCl组细胞中的β-catenin、c-myc蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图3和表4)。提示，Wnt信号激活剂可以提高转染miR-26b mimics后子宫内膜癌细胞中Wnt信号激活水平。

2.5 Wnt信号激活剂逆转上调miR-26b对子宫内膜癌细胞侵袭和迁移影响

与Ishikawa+miR-26b组比较,Ishikawa+miR-26b+LiCl组侵袭数目、迁移数目增多,细胞中E-cadherin蛋白水平下降,vimentin蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图4和表5)。提示，Wnt信号激活剂逆转上调miR-26b mimics对子宫内膜癌细胞侵袭、迁移和EMT影响。

图3 Western blot检测Wnt信号激活剂对转染miR-26b mimics后子宫内膜癌细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达影响Figure 3 Effect of Wnt signal activator on the expression of β-catenin and c-myc in endometrial cancer cells transfected with miR-26b mimimics by Western blot

组别β-cateninc-mycIshikawa+miR-26b组0.42±0.040.36±0.07Ishikawa+miR-26b+LiCl组0.74±0.06∗0.58±0.06∗ T7.6864.133 P0.0020.015

与Ishikawa+miR-26b组相比,*P<0.05

图4 Western blot检测Wnt信号激活剂对转染miR-26b mimics后子宫内膜癌细胞中E-cadherin、vimentin蛋白表达影响Figure 4 Effect of Wnt signal activator on the expression of E-cadherin and vimentin in endometrial cancer cells transfected with miRNA-26b mimics after treated with Wnt signal activator by Western blot

组别迁移数目侵袭数目E-cadherinvimentinIshikawa+miR-26b组98.54±10.2382.65±7.690.68±0.070.30±0.04Ishikawa+miR-26b+LiCl组157.23±11.78127.43±10.560.28±0.030.52±0.05 t6.5165.9379.0975.951 P0.0030.0040.0010.004

3 讨论

miRNA是存在于生命机体内的非编码RNA,在人体多种细胞生长、能量代谢、分化等过程中发挥作用,miRNA是生命进程中的重要调控因子[10]。研究显示,miRNA在肿瘤组织中异常表达,并且其可以作为肿瘤预后、病理分期等的参考指标[11]。miRNA还与肿瘤细胞的恶性转化有关,miRNA在肿瘤进展中发挥促进或抑制作用[12]。miR-26b在很多实体肿瘤中表达下调,例如乳腺癌等[13]。miR-26b与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力有关,上调miR-26b后的宫颈癌细胞侵袭和迁移能力降低[14]。以前的研究显示,miR-26b在子宫内膜癌中低表达,并且其表达水平的高低与子宫内膜癌患者的淋巴结转移具有相关性[8]。本次实验表明,上调miR-26b表达后的子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力下降,提示miR-26b在子宫内膜癌细胞体外转移潜能中发挥抑制作用。

肿瘤转移一直是肿瘤患者死亡的重要原因,肿瘤转移是一个复杂过程,与细胞内多种基因的异常表达改变有关[15]。研究报道显示,肿瘤细胞EMT是肿瘤转移的标志,并且发生EMT的肿瘤细胞转移的概率明显增加[16]。EMT是广泛存在于正常生命进程中的生理过程,在这一过程中,细胞的上皮特性逐渐消失,并且表现出明显的间质细胞特性。E-cadherin、vimentin分别为上皮细胞和间质细胞标志蛋白,E-cadherin表达水平降低而vimentin表达水平升高是细胞EMT的标志[17]。本次实验表明,上调miR-26b后的子宫内膜癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高而vimentin表达水平降低,提示上调miR-26b可以抑制子宫内膜癌细胞EMT,这也证实上调miR-26b在子宫内膜癌转移中可能发挥抑制作用。

Wnt是存在于低等生物(如果蝇)到高等哺乳动物中的保守信号转导通路,在人类胚胎发育、组织修复等过程中均发现有Wnt信号通路的调控作用[18]。Wnt信号异常激活还与人类疾病的进展有关,例如Wnt在脑缺血再灌注神经损伤中激活水平降低,而激活Wnt信号通路可以通过调控细胞自噬而改善大鼠神经功能;Wnt还参与动脉粥样硬化炎症反应[19,20]。β-catenin是经典Wnt信号通路的关键蛋白,其表达水平的高低是Wnt信号通路激活水平的标志[21]。c-myc是Wnt信号的下游靶蛋白,也是目前公认的癌基因。之前的研究显示,miR-26b调控心肌细胞、类风湿关节炎滑膜成纤维细胞生物学行为与Wnt信号有关[22]。本次实验显示,上调miR-26b后的子宫内膜癌细胞中β-catenin、c-myc蛋白表达减少,并且Wnt信号激活剂可以逆转上调miR-26b对子宫内膜癌细胞侵袭、迁移和EMT的影响,提示上调miR-26b通过抑制Wnt信号激活而影响子宫内膜癌细胞的转移潜能。

总而言之,miR-26b在子宫内膜癌进展中可能发挥抑制作用,上调miR-26b可以通过Wnt信号通路抑制子宫内膜癌细胞侵袭、迁移和EMT,这为研究miR-26b在子宫内膜癌中的作用机制提供了参考,为子宫内膜癌的治疗提供了新思路。目前对于miR-26b具体的靶向调控位点和作用机制还不清楚,在今后的实验中会进行探讨。