钙调蛋白小亚基Capn4对依托铂甙诱导的鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤修复NHEJ通路相关蛋白的作用

王 丰,王 慧,吴丽贤,郑 鸣*

(1福建中医药大学中西医结合学院解剖学教研室,福州 350004;2福建医科大学药学院药理学系药理学教研室;*通讯作者,E-mail:zming-1956@163.com)

鼻咽癌是起源鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤,发病率具有明显的地域分布特征,在东南亚地区和中国南方有极高的发病率[1]。鼻咽癌的主要治疗手段是放疗,总体疗效较好,但仍有较多患者存在放疗照射野内局部的残留和复发,提示在这部分患者中存在放疗抵抗,这与DNA损伤修复(DNA damage repair,DDR)有密切的关系[2]。不能修复的DNA双链断裂(DSB)将导致肿瘤细胞死亡。DNA修复能力异常激活和增强是导致鼻咽癌细胞对放化疗耐药的重要分子基础;相反,修复缺陷则增强肿瘤对放化疗敏感性。依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物,诱导人鼻咽癌细胞产生DNA双链损伤,有文献报道VP-16诱导DNA损伤的同时,促进NHEJ修复,这可能是鼻咽癌化疗抵抗的原因之一[3]。Capn4是钙调蛋白小分子亚基,使Calpain形成二聚体。Calpain参与多种肿瘤细胞的增殖和凋亡[4,5]。本课题组前期研究结果显示抑制Capn4表达能够下调VP-16所致的鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤修复,该作用可能通过抑制DNA损伤后NHEJ修复通路实现[6]。本研究探讨抑制Capn4表达后NHEJ修复通路相关蛋白Ku80的表达,并通过体内异种移植瘤模型检测VP-16对下调Capn4表达鼻咽癌肿瘤的抑瘤率。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

人鼻咽癌细胞CNE2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。Capn4下调的人鼻咽癌细胞CNE2Capn4(-)和空载体转染的对照细胞CNE2Vector为药学院药理实验室构建。质粒DNA小量提取试剂盒(QIAprep spin Miniprep Kit)(QIAGEN,德国);FUGEN6转染试剂(Promega公司,美国);DNA Ladder(北京碧云天生物技术研究所);高内涵检测所需试剂:试剂盒(美国BD公司);Ku80、DNApks单克隆抗体(Abcam公司);二抗(凯基生物公司)。

RT-PCR所需试剂:BIOZOL总RNA提取试剂(杭州博日科技);BioRT cDNA第一链合成试剂盒(杭州博日科技);BioEasy SYBR Green I RT-PCR kit(杭州博日科技);引物(上海吉凯基因)。VP16来自齐鲁制药。

1.2 细胞培养

CNE2细胞、293T细胞、CNE2Vector和CNE2Capn4(-)培养于含10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml和链霉素100 μg/ml的RPMI 1640培养液中,置37 ℃、5% CO2孵育箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。

1.3 DNA损伤后NHEJ修复通路检测

将NHEJ通路特异性的质粒EJ5-GFP用Fugen6 HD转入空载体CNE2Vector和下调表达的CNE2Capn4(-)细胞,选择稳定表达EJ5-GFP的细胞株,转入pCBASceI质粒表达I-SceI酶,切割EJ5-GFP基因,形成双链断裂(DSB),如果细胞通过NHEJ途径修复将表达GFP,用高内涵仪检测GFP的阳性率,可检测出通过NHEJ修复的细胞。

1.4 高内涵检测细胞DNA损伤后Ku80的表达

取对数生长期CNE2Vector和CNE2Capn4(-)细胞接种96孔板,待24 h细胞贴壁后,用2.5 μmol/L的VP-16浓度处理CNE2Vector细胞和CNE2Capn4(-)细胞2 h;收集细胞,PBS洗涤两次;每管加入100 μl固定液,室温15 min,用100 μl Wash Buffer洗涤2次,每次10 min,;每孔加入100 μl Permeabilization Buffer,室温15 min,用10 μl Wash Buffer洗涤2次,每次10 min,弃上清;每孔加入100 μl Blocking Buffer,室温15 min,弃上清;每孔加入50 μl一抗Ku80抗体(1 ∶1 000),室温1 h,用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗涤2次,每次10 min;用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗涤2次,每次10 min;每孔加入50 μl二抗(1 ∶1 000),室温避光45 min,用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗涤2次,每次10 min;用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗涤2次,每次10 min;每孔再加入新的200 μl Wash Buffer,上机检测。

1.5 RT-PCR检测Ku80、DNA-PKs的相对表达量

利用2-ΔΔCt相对定量法可以准确地检测出各个目的基因的相对转录水平。从GenBank查询Ku70、Ku80基因的mRNA序列,以GAPDH为内参,运用Primer Premier 5.0软件设计引物并用Oligo 6.0来分析引物。引物由上海吉凯基因公司合成。通过内参基因GAPDH定量结果对各个目的基因定量值进行归一化处理后,以对照组目的基因转录表达量作为参照,获取其他各组基因的相对转录水平。

取对数生长期的CNE2Capn4(-)和CNE2Vector细胞,计数,调整细胞最终浓度为5×105个/ml,2 ml/皿,接种到6 cm的培养皿中。收集细胞,用PBS洗涤细胞两次,2 000 r/min,离心5 min,弃上清,加入1 ml BIOZOL试剂,用移液器反复吹打裂解细胞。将样品在室温下孵育15 min,加入200 μl氯仿,盖紧管盖,振荡混匀并将其在冰上孵育15 min。于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,RNA存在于上清层中,加入等体积冰浴的异丙醇,颠倒振荡混匀,将混合的样品在-20 ℃孵育20 min。4 ℃,12 000 r/min离心10 min,弃上清,加入1 ml冰浴的75%乙醇,颠倒洗涤离心管管壁,并旋涡振荡样品。4 ℃,12 000 r/min离心5 min,去上清,在阴凉处晾干沉淀。加入50 μl无RNA酶水溶解RNA沉淀。使用NanDrop 2000超微量分光光度计检测样品RNA的浓度和纯度。配制RT反应液。逆转录反应条件为:室温10 min,42-60 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min,冰浴5 min。使用Biorad MyCycler Thermal Cycler基因扩增仪进行逆转录反应。合成的cDNA立即做PCR扩增或保存于-70 ℃。在冰上配制PCR反应液。充分混匀反应液,分装至各个PCR反应管中。将加好模板的PCR反应管进行短暂离心。RT-PCR反应程序设置为:94 ℃ 2 min,94 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40个循环,荧光信号采集在72 ℃。

表1 定量PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for quantitative PCR

检测基因引物序列(5′-3′) Ku70 Ku80 DNA-PK BRCA1 Human GAPDH sense:GTCTGTGCCAACCTCTTTAGTGantisense:AACAGGTCTTCTAGCTTGCTGsense:CAGTGTCACCTCTGTTGGAAGTGantisense:AAGGCTCGGATGCAGTCTATGsense:ACCACGACTCTGCTAAACACCantisense:TCAGGAAGATGAGCCATAACCsense:CCCTGATACTTTTCTGGATGCCantisense:TTGTTACAAATCACCCCTCAAGGsense:CGCTGAGTACGTCGTGGAGTCantisense:GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC

1.6 裸鼠体内成瘤实验

5周龄的雌性裸鼠,体质量18-22 g;随机分为4组:CNE2Vector组、CNE2Vector+VP-16组、CNE2Capn4(-)组、CNE2Capn4(-)+VP-16组,每组6只。取对数生长期的CNE2Capn4(-)细胞系和对照组CNE2Vector细胞,胰酶消化,制备单细胞悬液,无血清培养液洗涤2次,用PBS(pH7.4)调整细胞密度5×106/ml,用质量浓度为4 g/L的台盼蓝染色,活细胞计数大于98%;无菌条件下,用注射器抽取肿瘤细胞悬液接种于裸鼠背侧靠右腋窝皮下,每只裸鼠接种0.2 ml,含活细胞数1×106,注射局部出现明显皮丘,定期观察裸鼠精神、饮食及体质量变化情况;待裸鼠皮下均出现结节时,腹腔注射VP-16溶液0.2 ml(10 mg/kg),对照组注射0.2 ml生理盐水,每周3次,连续2周。处死裸鼠,取出瘤块,去除表面的脂肪组织,测量瘤块的长度(L)和宽度(W),按公式(肿瘤体积=1/2×L×W2)计算肿瘤的体积,称重,比较各组瘤体的平均重量,计算肿瘤生长抑制率。抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%,进行统计学分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 高内涵技术检测VP16对CNE2Vector和CNE2Capn4(-)细胞NHEJ修复通路的影响

NHEJ通路特异性质粒转入细胞，结果见图1。将细胞分为四组:A组,无用药共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Vector;B组,VP-16作用48 h共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Vector;C组,无用药共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Capn4(-);D组,VP-16作用48 h共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Capn4(-)。结果显示,在获得Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位的表达EJ5-GFP的细胞中,2.5 μmol/L VP-16作用48 h的CNE2Capn4(-)细胞,与2.5 μmol/L VP-16作用48 h的CNE2Vector细胞相比较GFP平均荧光强度明显更低,差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。

图1 NHEJ通路特异性质粒的表达Figure 1 Expression of NHEJ pathway specific plasmids

2.2 高内涵检测细胞DNA损伤Ku80的表达

用2.5 μmol/L VP-16浓度处理CNE2Vector细胞和CNE2Capn4(-)细胞2 h,洗掉药物,加入新培养基重新孵育,在0,6,12 h,高内涵检测各组细胞Ku80的平均荧光强度。结果显示,在6,12 h,CNE2Capn4(-)的Ku80的平均荧光强度都较空载体的CNE2Vector细胞弱,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

A.无用药共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Vector;B.VP-16作用48 h共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Vector;C.无用药共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Capn4(-);D.VP-16作用48 h共同转染EJ5-GFP和Ⅰ-SceⅠ限制性酶切质粒的CNE2Capn4(-)图2 高内涵检测VP-16对CNE2细胞NHEJ修复通路的影响Figure 2 Effect of high content technique on NHEJ repair pathway in CNE2Vector with different treatment

图3 高内涵检测VP-16对CNE2细胞NHEJ修复通路中Ku80的影响Figure 3 Effect of high-content detection of VP-16 on Ku80 in NHEJ repair pathway of CNE2 cells

2.3 RT-PCR检测Ku80和DNA-PKs的相对表达量

RT-PCR检测结果显示,下调Capn4的CNE2细胞RNA转录水平上Ku80、DNA-PKs及BRCA1与对照组相比有一定的下调,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。

2.4 下调Capn4表达对VP-16治疗鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响

利用裸鼠体内成瘤实验研究下调Capn4表达对鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响以及对鼻咽癌的化疗是否起增敏的效果,结果见图5。VP-16给药CNE2Capn4(-)细胞系的裸鼠体内成瘤体积较小、体内成瘤重量较轻,差异有统计学意义(P<0.01);VP-16给药CNE2Capn4(-)细胞系的裸鼠体内成瘤抑瘤率较高,差异有统计学意义(P<0.01)。

与CNE2Vector比较,*P<0.05,**P<0.01图4 RT-PCR检测下调Capn4的CNE2细胞中Ku80、DNA-PKs的相对表达Figure 4 Relative expression of Ku80 and DNA-PKs in CNE2 cells after down-regulation of Capn4 by RT-PCR

图5 下调Capn4表达对VP-16治疗鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响Figure 5 Effect of down-regulation of Capn4 expression on tumorigenic ability of VP-16 in nasopharyngeal carcinoma cells

3 讨论

细胞应对DNA双链断裂(DSB)的主要机制是同源重组修复(HR)[7]和非同源末端连接修复(NHEJ)[8]。同源重组主要作用于细胞周期的S期和G2期,在损伤部位按同源重组方式修复DNA序列。与同源重组相反,NHEJ发生在整个细胞周期。NHEJ是通过直接将DSB的末端连接而介导修复。有时这个过程可能导致DSB位点处或周围的DNA序列的缺失或突变。因此,与同源重组相比,NHEJ虽然在机制上更简单,但通常可以是不稳定并容易诱发突变的。

在20世纪80年代初,Ku首次被鉴定为自身免疫性疾病(硬皮病多发性肌炎重叠综合征)的患者血清中的自身抗体靶向的自身抗原[9]。随后的报道显示,Ku具有不寻常的DNA结合特性,以序列非依赖性方式与双链DNA分子末端结合[10]。两个Ku亚基(Ku80和Ku70)被发现与放射敏感的细胞系的DNA修复缺陷有关[11]。现在已经确定,Ku对于维持基因组完整性和适当的细胞和有机体发育至关重要。

NHEJ的初始步骤是Ku快速识别DSB。Ku的丰度(在人类中,每个细胞约500 000个分子)和对DNA的强亲和力允许它在5 s的损伤内与DNA末端结合[12]。Ku结合具有DNA保护作用,而在Ku缺陷型细胞中,在DSB末端发生核裂解。一旦Ku通过其中心环结构域包围了DNA,就能直接间接地与几种NHEJ因子相互作用,成为整个NHEJ复合物的支架。

越来越多的证据表明,与DNA-PKcs一起,Ku本身介导了C-末端连接复合物的DNA末端桥连和稳定。通过重组Ku蛋白体外连接两个放射性标记的DNA末端,以及通过电子和原子力显微镜观察Ku依赖性DNA片段的连接证明Ku可能作用于桥接DNA末端[13]。最近的研究观察到Ku80的损失导致DNA末端之间的距离增加[14]。

钙蛋白酶Capn4(又称CapnS1)是calpain蛋白的一个小分子调节亚基,在调节calpain的稳定性和活性中发挥着至关重要的作用。多项研究表明Capn4的缺失引起calpain-1(μ-calpain)和calpain-2(m-calpain)功能障碍。最近的研究表明[15],钙蛋白酶是一种重要的DNA修复调节蛋白。已经证明,m-calpain可以从胞浆转移到细胞核,转位的m-calpain能够水解拓扑异构酶Ⅰ,后者能在细胞周期中产生DNA断裂。拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性在被m-calpain水解后更加加强。μ-calpain和m-calpain参与几种细胞过程,例如转录,凋亡,维持细胞结构和致癌作用[4,5]。它们的异常活化已经涉及许多疾病如阿尔茨海默氏病,肌肉功能障碍,心肌梗死和肿瘤的发病机制。然而,钙蛋白酶同工酶特异性切割核蛋白,其在与疾病相关的病理发生中的生物学重要性和作用仍未完全研究。在这方面,目前的研究集中在m-calpain在DNA DSB修复中的作用。通过2D-凝胶和MS分析可以看出,离子霉素激活和易位的m-calpain使ERK激酶的表达水平显著减少,而抑制ERK激酶的激活能够活化DNA-PKcs从而增强了DNA DSB修复的NHEJ途径[16]。

当各种DNA损伤剂如IR,化学治疗,UV光和放射治疗引起DSB时,Ku70和Ku80形成异二聚体,并通过结合DSB的两端引发NHEJ修复途径,随后招募其他修复蛋白质如DNA-PK,XRCC4和连接酶Ⅳ[17]。钙调蛋白小亚基Capn4是否能够通过激活Ku80/Ku70达到激活NHEJ修复通路的作用,目前还未有定论。

本实验用依托泊苷建立鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤,观察敲除钙调蛋白小亚基Capn4的表达,高内涵分析显示下调Capn4的表达能够抑制CNE2细胞DNA损伤后NHEJ修复通路,并且下调Capn4表达能够抑制VP16诱导的CNE2细胞NHEJ通路相关蛋白Ku80的表达,提示钙调蛋白可能通过与Ku80或其他NHEJ修复通路相关蛋白相互作用影响NHEJ修复通路。裸鼠体内成瘤实验研究下调Capn4表达能抑制鼻咽癌细胞体内成瘤能力并对鼻咽癌的化疗起增敏的效果。下调钙调蛋白可抑制鼻咽癌细胞DNA损伤后修复,从而增敏放化疗药物的DNA损伤效应。