白桦脂酸通过阻断Fas-Fasl信号通路抑制异氟醚诱导的大鼠脑神经元损伤

寿琼华,解雅英

(内蒙古医科大学附属医院麻醉科,呼和浩特 010050;*通讯作者,E-mail:qionghua-shou66@126.com)

异氟醚具有麻醉诱导快、无刺激、苏醒迅速等特点[1,2]。但是近年来越来越多的学者认为异氟醚具有一定的神经毒性,尤其是对小儿神经发育有较大的影响。研究表明,异氟醚可诱导幼鼠细胞凋亡、神经发育阻滞,并造成一定程度的学习记忆功能障碍[3,4]。白桦脂酸(betulinic acid,BA)是一种五环三萜酸,主要从白桦树皮中提取[5]。研究表明,BA具有诸多生物活性,具有一定的抗肿瘤作用[6,7],另外白桦脂酸可以通过调节Bcl-2、Caspase3来抑制药物引起的急性肝损伤,因此我们推测白桦脂酸可以抑制异氟烷诱导的脑神经元的凋亡。因此,本实验以大鼠海马神经元为研究对象,研究白桦脂酸对异氟醚诱导的发育期大鼠脑神经元细胞的影响,并探讨其通过阻断Fas-Fasl信号通路抑制神经元损伤的干预机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄SPF级SD大鼠,购自于北京维通利华有限责任公司(许可证号SYXK(京)2017-0022),雌雄各半,于25 ℃ SPF环境下饲养。

1.2 主要试剂

10%胎牛血清(上海碧云天公司);线粒体荧光染料(上海碧云天公司);高速低温离心机(北京时代北利离心机有限公司);青霉素(上海碧云天公司);链霉素(上海碧云天公司);异氟醚(济南晟齐医药科技有限公司);白桦脂酸(上海纯优生物科技有限公司);KGA107凯基细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司);NovoCyte流式细胞仪(艾森生物(杭州)有限公司);RTCA实时细胞分析系统(艾森生物(杭州)有限公司);美国伯乐PCR仪(美国Bio-rad公司)。

1.3 海马组织神经元分离培养

大鼠用水合氯醛麻醉后断颈处死后取海马组织,剪碎海马组织,加入胰蛋白酶(1.5 g/L)于37 ℃、CO2的培养箱中消化25 min,加入含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基。1 500 r/min离心5 min并用PBS洗涤,重复3次。调整海马细胞水平并接种于9孔培养板,加入阿糖胞苷10 mg以抑制神经细胞的增殖。将海马神经元细胞于DMEM培养基(含10%胎牛血清、10 mmol/L的HEPES缓冲液及100 U/ml的青霉素和链霉素)培养,于37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境传代培养,2-3 d更换1次培养液。

1.4 动物分组及模型制备

将海马神经元细胞随机分为对照组、异氟醚诱导组、白桦脂酸低剂量组(0.001 mol/L)、白桦脂酸中剂量组(0.005 mol/L)、白桦脂酸高剂量组(0.01 mol/L)。异氟醚诱导组细胞于2.4%异氟醚环境中暴露2 h,白桦脂酸给药组分别给药培养后置于2.4%异氟醚环境中暴露2 h,对照组于正常环境中培养。

1.5 流式细胞仪检测脑神经元细胞凋亡

将处于对数生长期的大鼠脑神经元细胞接种于12孔细胞培养板,1×104个细胞/孔。实验设计4个组别(对照组、白桦脂酸低剂量组、白桦脂酸中剂量组、白桦脂酸高剂量组),每组3个平行孔。胰蛋白酶消化并收集细胞。按照KGA107凯基细胞凋亡检测试剂盒说明书,用PBS清洗各孔,1 500 r/min离心5 min,去上清,用预冷的PBS重悬。反复操作3次,凋亡抗体染色后,37 ℃避光孵育20 min，随后用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 PCR法检测Fas、Fasl及caspase-8基因

采用聚合酶链式反应(PCR)检测Fas、Fasl及caspase-8 mRNA表达水平。PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min，93 ℃变性40 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸40 s，循环35次，最后72 ℃延伸60 s。取10 μl扩增产物和6 μl的Maker同时上样，琼脂糖凝胶电泳分离(120 V 40 min)，银染色，紫外凝胶成像系统分析扩增结果。Fas、Fasl及caspase-8的引物序列见表1。

表1 Fas、Fasl及caspase-8的引物序列

Table 1 Primer sequences of Fas, Fasl and caspase-8

基因上游引物上游引物Fas5′-CGATT CTGAG ATGGT GAA-3′5′-TGGT TCTTG TCTGT GTAAT-3′Fasl5′-TGTCT CCTTG TGATG TTC-3′5′-GATGA TTCTG TATCGC CTTTG-3′caspase-85′-GAT GAG GCA GAC TTT CT G CT-3′5'-CAT AGT TCA CGC CAG TCA GGA T-3′

1.7 Western blot分析cyt c、BID、caspase-9、Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表达水平

SDS-PAGE电泳凝胶并置于电泳槽上,将细胞cyt c、BID、caspase-9、Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白上样并电泳。电泳后转印到PVDF膜上,封闭并用TBST清洗后分别加入稀释过的蛋白抗体(cyt c 1 ∶400、BID 1 ∶400、caspase-9 1 ∶400、Bcl-2 1 ∶400、Bax 1 ∶400、caspase-3 1 ∶400 PARP 1 ∶400),4 ℃过夜，TBST清洗4次(每次5 min)；随后加入HRP标记的二抗(稀释比例1 ∶400)，37 ℃孵育2 h，TBST洗4次×5 min。设立阴性对照组，以GAPDH单克隆体为一抗(稀释比例1 ∶400)，HRP标记的IgG为二抗。

1.8 线粒体膜电位(MTP)的测定

将分离提取的线粒体于1 000 r/min离心5 min,弃上清,用新的培养基重悬细胞;加入15 nmol/L的活细胞线粒体的荧光染料,37 ℃孵育35 min，1 000 r/min离心5 min,PBS冲洗3次。取细胞悬液1 ml,用流式细胞仪分析并绘制线粒体膜电位的荧光值分布图,以荧光强度表示线粒体膜电位变化,即荧光强度越高则线粒体膜电位越高。流式细胞仪激发光波长488 nm,发射光波长530 nm。

1.9 线粒体呼吸功能的测定

氧电极法测定线粒体的呼吸功能。定标氧电极,在反应杯中分别加入200 mmol/L的蔗糖、15 mmol/L的Tris、15 mmol/L的EGTA、15 mmol/L的磷酸二氢钾1 ml,并加入0.5 ml线粒体悬液。待溶氧曲线稳定后,加入10 mmol/L的琥珀酸钠;再次等待曲线稳定,加入0.05 mmol/L的ADP。计算Ⅲ态呼吸曲线斜率和Ⅳ态呼吸曲线斜率，并以两者比值数值越大表示线粒体呼吸功能越强。

1.10 神经元细胞ATP含量检测

将神经元细胞接种于12孔培养板,按照ATP含量测定试剂盒说明书进行操作,并利用紫外分光光度计测量各孔450 nm吸光度值,按以下公式计算细胞内ATP含量。ATP含量=[(测定OD值-对照OD值)/(标准-空白)]×标准样浓度(1×103μmol/L)×样本测试前稀释倍数/待测样本蛋白浓度。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 白桦脂酸抑制了异氟醚诱导的脑神经元细胞凋亡

异氟醚诱导组细胞凋亡率(早期、晚期凋亡率之和)高于对照组及给药组的细胞凋亡率;且随着白桦脂酸给药量剂量的增加,细胞凋亡比例逐渐降低。异氟醚诱导组与低剂量、中剂量白桦脂酸给药组细胞凋亡比例明显高于对照组,高剂量白桦脂酸给药组细胞凋亡比例明显低于异氟醚诱导组(P<0.05),但与对照组相比,差异不具有统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 不同处理后大鼠脑神经元细胞凋亡率(%)

Table 2 Rate of cell apoptosis of rat brain neuron after different treatment(%)

分组早期凋亡率晚期凋亡率凋亡率对照组3.72±0.521.25±0.494.85±0.86异氟醚诱导组23.13±4.69∗12.49±2.21∗35.56±5.25∗白桦脂酸低剂量组18.75±2.25∗#6.88±1.26∗#25.66±3.98∗#白桦脂酸中剂量组12.28±2.55∗#4.10±0.86∗#16.39±3.25∗#白桦脂酸高剂量组9.55±1.86∗#2.91±0.35∗#12.50±2.27∗# F12.37511.45214.815 P0.0210.0160.025

与对照组比较,*P<0.05;与异氟醚诱导组比较,#P<0.05

2.2 白桦脂酸对异氟醚诱导Fas、Fasl及caspase-8基因转录水平的影响

与对照组相比,异氟醚诱导后,大鼠脑神经元细胞Fas、Fasl及caspase-8 mRNA表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。白桦脂酸各给药组与异氟醚诱导组相比,均下调Fas、Fasl及caspase-8表达;且随着给药剂量的增加,Fas、Fasl及caspase-8基因转录水平逐渐降低,呈剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05,见图1、表3)。

2.3 白桦脂酸对异氟醚诱导cyt c、BID及caspase-9蛋白表达水平的影响

与对照组相比,异氟醚诱导后,大鼠脑神经元细胞cyt c、BID及caspase-9表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。白桦脂酸各给药组与异氟醚诱导组相比,cyt c、BID及caspase-9表达均下调,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2、表4)。随着给药量的增加,cyt c、BID及caspase-9蛋白表达水平逐渐降低,以高剂量组效果最为明显。

图1 RT-PCR检测不同处理后Fas、Fasl及caspase-8基因表达Figure 1 Expression of Fas,Fasl and caspase-8 after different treatment by RT-PCR

表3 白桦脂酸对异氟醚诱导Fas、Fasl及caspase-8基因转录水平的影响

Table 3 Effects of betulinic acid on isoflurane-induced Fas, Fasl and caspase-8 gene expression

组别FasFaslcaspase-8对照组1.06±0.061.02±0.051.08±0.09异氟醚诱导组4.45±0.21∗4.49±0.54∗5.23±0.20∗白桦脂酸低剂量组2.81±0.25∗#2.85±0.22∗#3.81±0.29∗#白桦脂酸中剂量组2.43±0.22∗#2.53±0.22∗#3.23±0.21∗#白桦脂酸高剂量组2.02±0.20∗#2.15±0.24∗#2.82±0.23∗# F10.3619.58710.209 P0.0190.0230.017

与对照组比较,*P<0.05;与异氟醚诱导组比较,#P<0.05

图2 Western blot检测cyt c、BID、caspase-9蛋白表达情况Figure 2 Expression of cyt c, BID and caspase-9 protein by Western blot

表4 白桦脂酸对异氟醚诱导cyt c、BID及caspase-9蛋白表达水平的影响

Table 4 Effects of betulinic acid on the expression of cyt c, BID and caspase-9 induced by isoflurane

指标cytcBIDcaspase-9对照组1.06±0.061.10±0.081.38±0.04异氟醚诱导组4.23±0.21∗4.79±0.52∗5.03±0.22∗白桦脂酸低剂量组2.74±0.20∗#2.95±0.18∗#3.74±0.21∗#白桦脂酸中剂量组2.20±0.27∗#2.24±0.22∗#3.18±0.19∗#白桦脂酸高剂量组1.98±0.17∗#1.95±0.23∗#2.62±0.23∗# F8.37511.7629.235 P0.0410.0210.026

与对照组比较,*P<0.05;与异氟醚诱导组比较,#P<0.05

2.4 白桦脂酸对异氟醚诱导Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表达水平的影响

与对照组相比,异氟醚诱导后,大鼠脑神经元细胞Bax、caspase-3及PARP蛋白表达水平显著升高,Bcl-2表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。白桦脂酸各给药组均能抑制Bax、caspase-3及PARP蛋白的表达,上调Bcl-2的表达,差异具有统计学意义(P<0.05,见图3,表5)。四者都以高剂量给药组作用效果最为明显,其次是中剂量给药组。

图3 Western blot检测Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表达情况Figure 3 Expression of Bcl-2, Bax, caspase-3 and PARP by Western blot

2.5 白桦脂酸对异氟醚诱导线粒体膜电位和呼吸功能的影响

与对照组相比,异氟醚诱导后,线粒体膜电位(以荧光强度表示)和呼吸功能显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与异氟醚诱导组相比,白桦脂酸各给药组线粒体膜电位水平增高,呼吸功能改善,差异具有统计学意义(P<0.05,见表6)。线粒体膜电位和呼吸功能与白桦脂酸给药剂量呈正相关,高剂量组效果最明显。

2.6 白桦脂酸对异氟醚诱导神经元内ATP含量的影响

与对照组相比,异氟醚诱导后,神经元内ATP含量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。白桦脂酸各给药组与异氟醚诱导组相比,ATP含量均有不同程度的升高,差异具有统计学意义(P<0.05,见表7)。其中高剂量给药组升高效果最明显,ATP含量达到(486.51±13.30)μmol/L,中剂量组次之。

表5 白桦脂酸对异氟醚诱导Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表达水平的影响

Table 5 Effects of betulinic acid on the expression of Bcl-2, Bax, caspase-3 and PARP induced by isoflurane

组别Bcl-2Baxcaspase-3PARP对照组1.18±0.051.02±0.051.49±0.041.09±0.06异氟醚诱导组0.43±0.06∗5.15±0.70∗5.42±0.53∗5.83±0.51∗白桦脂酸低剂量组0.62±0.09∗#4.09±0.55∗#3.57±0.81∗#4.45±0.50∗#白桦脂酸中剂量组0.91±0.04∗#3.41±0.23∗#3.18±0.40∗#3.89±0.32∗#白桦脂酸高剂量组1.05±0.05∗#2.15±0.10∗#2.81±0.34∗#2.88±0.20∗# F9.28212.30510.1729.6215 P0.0160.0030.0050.009

与对照组比较,*P<0.05;与异氟醚诱导组比较,#P<0.05

表6 白桦脂酸对异氟醚诱导线粒体膜电位和呼吸功能的影响

Table 6 Effects of betulinic acid on mitochondrial membrane potential and respiratory function induced by isoflurane

组别荧光强度呼吸速率(%)对照组7.20±0.474.72±0.32异氟醚诱导组4.40±0.38∗1.49±0.03∗白桦脂酸低剂量组5.01±0.57∗#2.05±0.05∗#白桦脂酸中剂量组5.67±0.43∗#2.73±0.22∗#白桦脂酸低高量组6.52±0.30∗#4.15±0.24∗# F11.24113.815 P0.0260.015

与对照组比较,*P<0.05;与异氟醚诱导组比较,#P<0.05

表7 白桦脂酸对异氟醚诱导神经元内ATP含量的影响

Table 7 Effects of betulinic acid on the content of ATP in isoflurane-induced neurons

组别ATP含量(μmol/L)对照组547.20±13.42异氟醚诱导组134.22±16.36∗白桦脂酸低剂量组405.21±12.53∗#白桦脂酸中剂量组445.07±14.42∗#白桦脂酸低高量组486.51±13.30∗# F15.245 P0.011

与对照组比较,*P<0.05;与异氟醚诱导组比较,#P<0.05

3 讨论

近年来异氟醚对神经系统的毒害作用引起广泛关注[8,9]。研究表明,异氟醚可引起神经发育敏感期的组织发生病理学损伤性改变,诱导海马组织细胞凋亡[10,11]。研究同时证实,Fas、FasL蛋白的表达与细胞凋亡程度呈正相关,Fas/FasL信号通路参与了脑神经元细胞凋亡过程[12]。

Fas是位于人10号染色体q24.1区的跨膜糖蛋白[13],FasL作为Fas在体内的天然配体,两者结合后可启动细胞凋亡程序,激活下游信号蛋白,促使神经元细胞发生凋亡。caspase-3、8、9作为caspase家族的重要成员,是Fas介导凋亡信号下游的关键性效应蛋白酶,尤其是caspase-3,其在细胞质中的高表达预示着细胞发生不可逆转的凋亡[14]。

cyt c是线粒体介导细胞凋亡的重要因子,当细胞受到凋亡刺激时,它的表达量会上调并激活caspase级联反应促使神经元细胞发生凋亡[15,16]。而Bcl-2可通过阻碍cyt c的释放,阻断caspase蛋白酶的激活,最终抑制细胞凋亡[17]。此外,Bax、BID、PARP的高表达亦可引起神经元细胞的凋亡[18]。白桦脂酸可通过激活Fas/FasL通路调节凋亡相关基因、蛋白的表达,从而达到抗癌、抗HIV、抗炎等目的[19-21]。但是关于其对脑神经元细胞凋亡影响及作用机制的研究较少,因此探究白桦脂酸对海马体神经元细胞的凋亡影响及可能的作用机制对于脑损伤的治疗具有重要的意义。

本研究采用异氟醚诱导发育期大鼠脑神经元损伤,流式细胞检测结果表明不同浓度的白桦脂酸均能够显著降低细胞凋亡比例;线粒体是哺乳动物细胞内的重要细胞器,是呼吸链电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的主要场所。线粒体膜电位是线粒体发挥生物学功能的重要基础。线粒体膜电位的破坏,对于细胞凋亡具有重要影响。本研究通过氧电极和紫外分光光度检测表明各白桦脂酸给药组均能提高大鼠线粒体呼吸水平和细胞内ATP含量。进而提示白桦脂酸对于维持线粒体稳定以及抑制神经元凋亡具有重要作用。本研究表明,一定浓度的白桦脂酸能够下调凋亡相关蛋白Fas、Fasl、caspase-8、cyt c、BID、caspase-9、Bax、caspase-3、PARP的表达,并上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达。该结果说明了Fas/FasL通过内源和外源两条通路引起大鼠神经元细胞凋亡,白桦脂酸可通过调节Fas/FasL信号通路相关基因以及蛋白的表达,从而达到抑制异氟醚对大鼠脑神经元细胞诱导的损伤,起到保护大脑脑神经元的目的。

综上所述,白桦脂酸抑制异氟烷诱导的脑神经元损伤的机制是通过下调凋亡相关蛋白Fas、Fasl、caspase-8、cyt c、BID、caspase-9、Bax、caspase-3、PARP的表达,上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,激活Fas/FasL信号通路最终引起细胞凋亡。但是其具体的作用机制还需要进一步的探讨。