超高效液相色谱—三重四级杆串联质谱法同时检测细胞培养基中种色氨酸代谢物

刘悦 贾曼 崔婧 甘敏 陈刚

摘 要：为研究色氨酸在细胞水平上代谢成为吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的转化率，本文建立了用超高效液相色谱-三重四级杆质谱法同时检测细胞培养上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，采用C18色谱柱、5mmol乙酸铵水及100%乙腈为流动相进行分离，多反应监测（MRM）负离子模式对3种物质进行检测，外标法进行定量。同时采用空白基质加标实验对方法的回收率及精密度进行了测量。方法线性较好，线性范围广，相关系数均为0.999，回收率在85%～102%之间，相对标准偏差在3.75%～8.75%之间。吲哚甲醛检出限及定量限分别为0.5、1.5ng/mL;吲哚乙酸检出限及定量限分别为5、10.0ng/mL;FICZ的检出限及定量限分别为0.3、1ng/mL。该方法为研究色氨酸代谢打下基础，同时也为评价高色氨酸饮食的营养价值提供新的思路。

關键词：吲哚甲醛;吲哚乙酸;FICZ;定量检测

色氨酸参与人体各项生理过程，调节机体的神经系统及免疫功能[1-5]。色氨酸属于必须氨基酸，维持机体正常生理功能所需的色氨酸必须依靠饮食获得[6]，色氨酸的含量是评价蛋白质品质的指标之一[7]。

目前，色氨酸的生理功能主要集中在对其犬尿氨酸及血清素代谢通路的研究，对吲哚丙酮酸通路的关注度很低，但作为吲哚丙酮酸途径的关键代谢产物，吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ对人体健康至关重要。一方面，摄入的色氨酸可被肠道中的微生物代谢产生吲哚乙酸及吲哚甲醛，调节人体细胞色素酶系统[8-9]，维持肠道免疫系统的稳定。吲哚甲醛还具有一定的抗菌活性。同时，尿液中吲哚乙酸含量的升高也被视为苯丙酮尿症的症状之一[10]。色氨酸的光解产物6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑（FICZ）能够诱导辅助性T细胞的增殖和分化，促进免疫系统活化[11]。另一方面，吲哚乙酸也是最早被发现的一种内源性植物生长激素，在农业生产中已广泛应用于果蔬催熟及改良品质等方面[12-13]，在植物各个器官中均有分布[12]。吲哚乙酸在可食用农产品，尤其是植物性农产品中的含量也与人体健康密切相关。

色氨酸存在于大多数可食用蛋白质中，且几乎存在于所有形式的植物蛋白中，大米、鸡蛋及牛奶等是色氨酸的主要食物来源。因此，有必要建立一套准确、可靠的色氨酸代谢物定量方法，实现对人体摄入色氨酸代谢通路的研究，为评价色氨酸的营养价值提供新的思路。目前对吲哚乙酸的检测方法主要有液质联用法、液相色谱法、离子色谱法及生物传感器法，目标基质大多为水果、蔬菜等植物类[16-19];对吲哚甲醛的检测目前报道较少，主要是液质联用法;FICZ也普遍采用液质联用方法检测[14-15，20]。为了研究色氨酸被细胞代谢为吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的转化率，建立了利用超高效液相色谱串联质谱法同时检测细胞培养上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，灵敏度高、线性范围广、方法简单，为研究色氨酸的体内外代谢提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（Agilent QQQ 6470，安捷伦公司）、离心机（Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge，Thermo Fisher公司），涡旋混合仪（GENIUS 3，德国IKA公司）、电子天平（AG245，瑞士Metler Toledo公司）、0.22μm滤膜、菲洛门C18色谱柱（粒径2.6μm，内径4.6 mmol，长度100 mmol）。

1.1.2 试剂 吲哚甲醛标准品（99%，Sigma）、吲哚乙酸标准品（99%，Sigma）、FICZ标准品（99%，Sigma）、甲醇（色谱纯，Thermo公司）、乙腈（色谱纯，Thermo公司）、纯净水（娃哈哈）、DMEM培养基（Invitrogen公司）、胎牛血清（Invitrogen公司）、乙酸铵（≥98%，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 吲哚甲醛和吲哚乙酸用甲醇配制成浓度为1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。FICZ标准品用DMSO溶液配制成浓度为1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。分别取吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ母液适量，用乙腈逐级稀释为工作液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为菲洛门C18色谱柱（粒径2.6μm、内径4.6mmol、长度100 mmol），流动相A为5mmol/L乙酸铵水，流动相B为乙腈;进样量5μL，流速0.4mL/min，柱温为35℃，后运行时间为2min（表1）。

1.2.3 质谱条件 离子源为电喷雾离子源负离子扫描（ESI-），多反应监测模式（MRM），鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，干燥气温度300℃，干燥气流速5L/min，毛细管电压-3 500V，雾化器压力45psi，喷嘴电压-500V（表2）。

2.2 检出限及定量限

本方法以信噪比（S/N）≥3的标准品浓度为检出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10的标准品浓度为定量限（LOQ）。FICZ的检出限和定量限最低，分别为0.3、1ng/mL。其次为吲哚甲醛，检出限和定量限分别为0.5、1.5ng/mL。吲哚乙酸的检出限和定量限分别为5、10ng/mL，为3种化合物之最高检出限和定量限浓度（表4）。

2.3 方法准确度及精密度

分别在空白培养基中添加高、中、低3种不同浓度的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ溶液，使培养基的标准品终浓度分别为10、100、500ng/mL，每个浓度设5个平行，重复3次。将空白培养基及加标培养基按前述前处理方法处理之后上机检测。回收率在85%～102%之间，相对标准偏差在3.75%～8.75%之间（表5）。

2.4 样品测定

收集用普通商業DMEM培养基、外源添加2mmol或5mmol色氨酸的培养基分别培养24h或48 h 后的293T细胞上清，对培养上清中的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ进行检测，从而判定人体细胞体外代谢色氨酸产生吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的水平。实验重复3次，每组2个平行。由Graphpad软件完成方差分析，P>0.05时为差异性显著，定量限以下视为未检出。由表6可以看出，293T代谢色氨酸产生吲哚甲醛及吲哚乙酸的水平与外源色氨酸浓度及培养时间呈正相关，FICZ在各组含量没有显著差异或未检出。结果表明，色氨酸能被293T细胞在体外代谢为吲哚甲醛、吲哚乙酸，为进一步研究色氨酸的体内吲哚丙酮酸代谢通路提供了科学依据。

3 结论

本方法样品前处理程序简单，操作便捷。考虑到细胞培养基成分相对单一，干扰杂质较少，因此前处理采用离心后过滤的方式去除大分子蛋白或其他杂质。本方法采用C18色谱柱分离，流动相5mmol乙酸铵水、100%乙腈实现了化合物的分离，峰型好、响应高。本方法的灵敏度高、线性范围广、回收率高且重现性好，为细胞代谢色氨酸产生的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ定量研究打下基础。◇

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