Wnt替代蛋白对oX-LDL致血管内皮细胞凋亡的拮抗作用

杨宏发 欧奇林 徐健强 曾高峰

[摘要]目的：研究Wnt替代蛋白（Wnt-S）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响及其可能机制。方法：在HEK293F细胞中瞬时转染pcDNA3.1（+）-Wnt-S质粒，表达纯化Wnt-S蛋白;Topflash，qPCR以及Western B10±实验确定最佳的Wnt-S激活Wnt信号通路浓度;MTT实验检测HUVEC存活率以及最佳的ox-LDL处理浓度;Hoechst染色检测细胞凋亡，Western B10±分析Cleaved Caspase-3蛋白的表达情况。结果：实验成功表达和纯化Wnt-S蛋白;Wnt-S蛋白的最佳激活浓度是100ng/mL;ox-LDL最佳处理浓度是60mg/L;Wnt-S蛋白提高HUVEC的存活率，可通过减少Cleaved Caspase-3而有效拮抗ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。结论：Wnt-S蛋白可通过激活Wnt细胞通路拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡。

[关键词]Wnt-替代蛋白，Wnt信号通路，氧化型低密度脂蛋白，细胞凋亡，动脉粥样硬化

[中图分类号]R363[文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）22-0001-03

动脉粥样硬化是现今最常见的心血管疾病之一，其患病率、发病率及死亡率在我国持续增长，给社会和家庭带来了沉重的负担。动脉粥样硬化的发病机制与内皮细胞损伤密切相关，其早期病理特征为血管内皮细胞功能的紊乱，由此引发血管结构和形态发生明显改变。内皮细胞功能的损伤被认为是动脉粥样硬化的关键环节，而其凋亡贯穿动脉粥样硬化始末。氧化型低密度脂蛋白（oxidized 10w density lipoprotein，ox-LDu是动脉粥样硬化中诱导内皮细胞凋亡的最常见因素之一，被认为是动脉粥样硬化发生发展的独立危险因素。

Wnt是一类分泌性糖蛋白，通过与其受体FZD和LRP5/6结合，诱导依赖于β-catenin的信号通路激活，进而调节多个生物过程。有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在血管发育，特别是维持内皮细胞稳态上起着关键作用。天然的Wnt蛋白由于侧链存在棕榈油酸酯修饰，水溶性差，难以表达纯化，极大地限制其生物和医学应用。根据Wnt信号通路激活的特点，构造出一种新型Wnt替代蛋白（Wn±surrogate，Wnt-S），由FZD受體的中和抗体Vantictumab的单链可变区（scFv，single-chain variable fragment）和LRP5/6结合蛋白DKKl的C端区域通过一个铰链区连接而成，形成一个新的融合蛋白scFv-DKKlc（图1）。这种人工合成的Wnt-S蛋白能模拟天然的Wnt蛋白，激活下游的Wnt/β-catenin信号通路，且易溶于水、容易表达纯化，在细胞和动物实验都显示出很好的生物功能。

本研究拟以人脐静脉内皮细胞（human umbilical veinendothelial celIs，HUVEC）为研究对象，以ox-LDL诱导内皮细胞功能紊乱为模型，探讨Wnt-S蛋白能否通过激活Wnt/β-catenin信号通路对ox-LDL诱导的HUVEC凋亡的影响及其可能的分子机制，为Wnt-S蛋白治疗动脉粥样硬化的临床应用提供理论依据和实验基础。

1材料和方法

1.1主要材料 pcDNA3.1（+）-Wnt-S，Luciferase和Rellina质粒来自斯坦福大学。PEI（Polysciences），N±SepharoseTM6Fas±F10w（GE Heahhcare），BCA蛋白定量试剂盒（ThermoFisher），ECL发光液（Millipore），Dual-Luciferase ReporterAssay System，His-Tag（D3110）XPRabbi±mAb和Anti-rabbitlgG，HRP-linked Antibody（中杉金桥）。DMEM高糖培养基和双抗（HyC10neTM），澳洲胎牛血清，FreestyleTM 293ExpressionMedium（Invitrogen）。TRIzol Reagent（Life±echno10gies），Direct-z01RNA Miniprep（ZYMO RESEARCH），反转录试剂盒和SYBRqPCR Mix（诺唯赞）。

1.2HEK293F细胞转染 转染前对HEK293F细胞行计数，用40mLPBS稀释质粒（800ug），混匀记为A液，用40mLPBS稀释PEI（1600ul），混匀记为B液（质粒：PEI=1：2，W/V），室温静置5min。将B液缓慢加入到A液中，用涡旋振荡器边加边振荡，室温静置15min。将DNA-PEI混合液缓慢加入到720mL Freestyle 293Expression培养基中，轻轻混匀，使细胞密度在约1x 10 cells/mL，置于37℃，5%CO，125r/min细胞培养箱的水平摇床中培养。每天取少量培养基，检测细胞活度，待细胞活度下降至70%左右时，停止培养，1000r/min离心收集上清，置于冰箱待用。

1.3Wnt-S蛋白表达纯化 组装好恒流泵，在纯化柱中加人0.5mL N±SepharoseTM 6Fas±F10w，开启恒流泵，用平衡液平衡纯化柱20min。将进液管插入含Wnt-S蛋白的上清底层，出液管插入Wnt-S蛋白的上清上方，液体匀速流过柱子，4℃环境下，纯化48h。用20mmol/mL，咪唑洗涤柱子后，再用500mmol/mL洗脱柱子，收集洗脱液，然后用10kDa离心过滤器进行超滤，4℃，8000r/min，15min条件下离心，浓缩后的液体即为Wnt-S蛋白溶液。

1.4±op-Flash实验 用于检测Wnt信号通路总体的激活情况。收集处理后的细胞，裂解液常温裂解15分钟后，取出裂解后的细胞悬液放人不透光的96孔板里。96孔板放人仪器，选取promega的双荧光素实验程序进行加样和读数（参照promega试剂盒说明书）。

1.5实时荧光定量PCR 用于检测Wnt信号通路下游基因Axin2的表达。收集处理后的细胞，Trizol裂解，RNA提取试剂盒提取总RNA，Nano Drop测定RNA的浓度，逆转录得到cDNA，然后进行qPCR（参照Takara试剂盒说明书）。

1.6Western b10±检测 蛋白BCA蛋白定量试剂盒检测样品的浓度，计算上样量。取一定量蛋白与5x蛋白上样缓冲液混匀，置于100℃金属浴中处理5min，配制10%分离胶和5%浓缩胶，进行电泳。电泳条件：80V，30min，120V至溴酚蓝进入浓缩胶底部。转膜条件：130mA，90-120min。5%BSA于TBST封闭2h，一抗4℃过夜孵育。TBST洗膜3次，5min/次，孵二抗，常温1h，TBST洗膜3次，5min/次，显影。

1.7HUVEC细胞培养及分组 HUVEC生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞贴壁并长至70%～80%时，用0.05%胰蛋白酶消化传代。HUVEC生长至传代融合度后，分别用lng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mLWnt-S蛋白刺激HUVEC24 h，以确定最佳的Wnt-S蛋白激活Wnt信号通路浓度。分别用20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L以及100mg/L的ox-LDL刺激HUVEC 24 h，以确定最佳ox-LDL处理浓度。Wnt-S蛋白抗凋亡实验实验分为空白对照组（Control）、OX-LDL组、ox-LDL+Wnt-S蛋白组。

1.8ox-LDL制备及鉴定 利用硫酸铜（CuSO4）修饰低密度脂蛋白制备ox-LDL，采用硫代巴比妥酸法鉴定。

1.9MTT法检测细胞存活率HUVEC细胞以5x 10/mL的密度接种于96孔板，每孔200ul。不同浓度的ox-LDL处理20小时后，每孔加入MTT（5mg/mL）20gl，37℃CO孵箱继续孵育4小时。采用翻板法将96孔板中培养基弃去，并注意要吸净板底残留培养基，每孔中加入溶解液DMSO 150ul，37℃振荡15min使结晶充分溶解，在酶标仪上以波长570nm检测每孔的OD值，每组5个复孔，实验重复3次。

1.10Hoeches±33342荧光染色法检测凋亡 HUVEC细胞以5x 10/mL的密度接种于96孔板，除空白对照组外，实验组处理24小时后，弃培养基，每孔加入4%多聚甲醛500gl，室温固定30分钟。PBS漂洗两遍后加入Hoechs±33342，使细胞中终浓度为10ug/mL，37度孵育30分钟后荧光显微镜下观察，最大激发波长361nm，最大发射波长460nm。正常细胞呈均匀的蓝色荧光，而凋亡细胞可见细胞核呈浓缩的半月形、分叶状或碎块状荧光。随机选取3个视野统计阳性细胞数，求平均值，每组2个复孔，重复5次，计算细胞凋亡发生率。

2结果

2.1Wnt-S蛋白表达载体的鉴定以及wnt-s蛋白的纯化和检测核酸电泳鉴定的结果显示Wnt-S i.pcDNA3.1（+）质粒成功构建。Wnt-S蛋白的细胞转染和表达Western Not结果表明在转染后的细胞上清中检测到了Wnt-S蛋白，其表达纯化的最佳条件为转染后5d收集上清，50mmol/mL咪唑洗涤柱子后，500mmol/mL咪唑洗脱（见图2）。

2.2Wnt-S蛋白对HUVEC细胞中Wnt/B-catenln信号通路的激活作用

首先，TOP flash结果显示Wnt信号通路的活性随着Wnt-S蛋白浓度的增加而显著升高，且存在剂量依赖性。其次，实时荧光定量PCR的结果显示加Wnt-S蛋白和Wnt3a蛋白处理后，HUVEC细胞中Axin2表达显著性上调，核内β-catenin蛋白明显增加，Wnt/β-eatenin信号通路被显著激活（见图3）。

2.3Wnt-S蛋白可拮抗ox-LDL引起HUVEC细胞存活率的降低将空白对照组细胞存活率设置为100%，选取20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L和100mg/L五个浓度的ox-LDL与HUVEC细胞共培养。MTT实验表明，与空白对照组相比，60mg/L的ox-LDL作用HUVEC 24 h后，细胞存活率降低至36.5%，选择此濃度进行后续实验。Wnt-S处理能显著拮抗ox-LDL所致HUVEC细胞存活率的降低（见图4）。

2.4 Wnt-S的对凋亡的抑制作用 选取60mg/L ox-LDL进行造模，100ng/mL Wnt-S蛋白做给药处理，ox-LDL组Hoechst染色结果可见更多的细胞核呈亮蓝色荧光，细胞核具有凋亡形态特点，而ox-LDL+Wnt-S呈亮蓝色荧光细胞核明显减少。进一步的机制研究发现，与空白对照组相比，OXmLDL组Cleaved Caspase-3表达显著上调（P<0.01）;而用Wnt-S处理后，Cleaved Caspase-3表达水平较ox-LDL组显著下调（P<0.01），表明ox-LDL能促进HUVEC中Caspase-3的活化，而Wnt-S蛋白可抑制ox-LDL诱导的HUVEC中Caspase-3的激活（见图5）。

3讨论

内皮功能障碍与凋亡是动脉粥样硬化发生发展的关键步骤，因此有效保护内皮细胞是改善动脉粥样硬化重要措施。本研究以OXLDL诱导HUVEC凋亡，在此基础上研究Wnt替代蛋白对ox-LDL诱导HUVEC凋亡的作用。结果显示，ox-LDL可显著降低HUVEC存活率，并诱导Caspase-3的活化和凋亡发生;而经Wnt替代蛋白处理后细胞凋亡率显著降低，且Cleaved Caspase-3表达也显著降低。提示Wnt替代蛋白可拮抗ox-LDL诱导的HUVEC凋亡，具有一定保护血管内皮的活性。

目前已经发现了19种不同的哺乳类Wnt蛋白，这些蛋白与10种FZD受体杂乱的结合，形成了不同的生物学功能。Wnt翻译后通过蛋白质棕榈化作用形成了棕榈油酸酯修饰，这个修饰对于Wnt蛋白的分泌和其与FZD相互作用的关键位点形成至关重要。然而，棕榈油酸酯化使天然Wnt蛋白变得非常疏水，这严重阻碍了Wnt重组蛋白的制备和应用。本文中，我们发现人工合成的Wnt替代蛋白具有与天然Wnt3a蛋白类似的生物学功能，都能激活HUVEC细胞中Wnt/β-catenin信号通路。Wnt-S蛋白的优势在于水溶性高、容易表达纯化和大规模制备，可能具有更广阔的生物和医学应用前景。

综上所述，本研究发现Wnt-S蛋白可通过激活Wnt细胞通路而减少Caspase-3活化，从而拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡，为Wnt-S蛋白在临床上应用于动脉粥样硬化的靶向治疗提供了理论依据。