不同预处理及提取方法对党参多糖的提取效果

徐美蓉 漆永红 李婷 李晓蓉 寇相龙

摘要：研究了不同的预处理方法及多糖提取方法对党参多糖提取效果的影响。结果表明，提取党参多糖最佳的预处理方法为低温冷冻干燥粉碎，与烘干粉碎提取法相比，多糖含量和产率分别提高了14.00%、49.58%。党参多糖提取最佳组合方式为低温冷冻干燥粉碎预处理与碱提取相结合，与常规热水提取相比，党参粗产量、多糖含量、多糖产率分别提高44.74%、61.32%、133.43%。通过高效液相色谱法检测低温冷冻干燥粉碎预处理后得到的党参多糖属性，发现处理方法对党参多糖的性质影响不大，但低温冷冻干燥粉碎预处理可以大大提高多糖的提取效率。

关键词：预处理;低温冷冻干燥粉碎;党参多糖;提取效果;多糖性质

中图分类号：S567      文献标志码：A      文章编号：1001-1463（2019）11-0059-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.11.015

Experimental study on tissue culture of Dendrobiumo fficinale in Tianshui area

LEI Ying， REN Yuxing， WU Lihong

（Gansu Forestry Professional Technology College， Tianshui Gansu 741020， China）

Abstract：The top bud of Dendrobium officinale potted in greenhouse were used as explants， the method of cross-grouping design was adopted. and cultured in MS + mashed bananas puddle. The different concentrations of plant growth regulators 2.4-D， NAA， IBA and 6-Ba were added in MS medium to induce the bushy buds of Dendrobium officinalis， and the effects on the proliferation and rooting of bushy buds were observed. The results showed that the best medium for inducing cluster buds of Dendrobium officinale were MS+6-BA 2.0 mg/L+2.4-D 1.0 mg/L and MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The optimum medium for multiplication of cluster buds was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The optimum medium for multiplication of cluster buds was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The transplanting matrix was perlite， forest leaf mould and pine needle mass ratio 1：1：1.

Key words：Tianshui area;Dendrobium officinale;Tissue culture ;Cross group design

黨参在我国具有悠久的应用历史，也是常用大宗药材。全世界党参属植物有40余种，我国是世界党参的主要产区和分布中心，主要产地为四川、贵州、陕西、山西等地，商品规格分为川党参、东党参、潞党参、白党参、西党参等[1 ]。党参除临床上用于中药饮片外，民间还常用于保健药品，可用来炖肉、煲汤。党参作为药食同源的中药材，所含的成分主要有多糖、皂苷、甾醇、三萜，生物碱、倍半萜及香豆素类等，其中多糖含量最大。研究表明，党参多糖在调节免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗应激、抗氧化等很多方面具有较好的生物活性[2 - 9 ]，其保健功效也越来越为人们所关注[10 - 13 ]。

党参主要糖类成分为菊糖和果糖，且细胞壁多糖含量较高。干燥的党参主要表现柔软木质化，并且多年生党参根周皮的木栓层为1层，木栓层细胞呈长方形，排列整齐，细胞壁栓质化，因此采用热水直接浸提多糖提取率不高。党参中多糖含量为19.27%～40.92%[14 ]，且其木栓层由纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质组成，不容易将党参充分干燥粉碎成微细颗粒，使有效物质能够得到充分的提取溶出。目前，有关党参多糖提取方法改进的报道较多，通过改进提取方法提高了党参多糖产量，但对党参的预处理方法研究较少。我们对比了不同预处理方法对党参多糖的提取效果的影响，旨在寻找一种最佳的预处理方法，为党参多糖的提取和利用提供新的思路。

1   材料和方法

1.1   供试材料

供试党参（Codonopsis）为一年生，当年10月收获，产地为甘肃省岷县。

供试试剂葡萄糖标准品购自中国计量科学院，纤维素来自诺维新公司，食用菌水解酶A01和木瓜蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司。磷酸二氢钠、氢氧化钠、五水硫酸铜（II）、柠檬酸钠、无水硫酸钠、氨、无水乙醇、浓硫酸和苯酚均为分析纯。

仪器设备：WJX-305高速多功能粉碎机，上海缘沃工贸有限公司;低温冷冻干燥机，北京博医康试验仪器有限公司;HR3653型破壁机，飞利浦公司生产;KQ2200DA型数控超声波清洗机，昆山超声仪器有限公司;P70D20TP-C6（WO）格兰仕微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司有限公司;SQP千分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）公司;DK-S26型电热恒温水浴锅，上海柏欣仪器设备厂;RE-5205旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D（III）循环水多用途真空泵，河南裕华仪器有限公司有限公司;DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱，上海柏欣仪器设备厂;LD5-10高速台式离心机，北京医用离心机厂;Cary50紫外可见分光光度计，美国瓦里安公司;沃特世2695高效液相色谱仪，美国沃特世公司。

1.2   样品处理

1.2.1    冷冻干燥处理    将党参样品清洗处理干净，切片处理，切片厚度为1～2 mm，放入冰柜冷冻4 h以上。将冷冻好的党参样品放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥24 h以上。党参样品经过冷冻干燥，取出一揉即碎即可，用破壁机打成粉末状，干燥储藏待用。

1.2.2    样品烘干粗粉碎处理    将党参清洗处理干净，切片处理，切片厚度为1～2 mm，放进恒温60 ℃烘箱烘至恒重，粉碎机打成粉末状，干燥储藏待用。

1.3   烘干预处理和提取

1.3.1    直接提取    取烘干粗粉碎处理样品4份，每份5 g，分别加水100 mL，沸水浴提取2.5 h，过滤后收集滤液。在相同条件下重复提取滤渣，最后合并滤液。通过真空浓缩蒸馏（温度为60 ℃）得到党参多糖粗提取物，测定多糖含量并计算粗产率、得率。

1.3.2    浸泡预处理和提取    取烘干粗粉碎处理样品4份，每份5 g，分别加水100 mL，搅拌1 min后静置，在室温下浸泡16 h后沸水浴提取2.5 h，重复提取2次，其他处理同1.3.1。

1.3.3    微波预处理和提取    取烘干粗粉碎处理样品4份，每份5 g，分别滴加15%乙     醇[6 ]。搅拌均匀后，在中火和低火下放入微波炉中加热3 min。然后取出加水100 mL，沸水浴提取2.5 h。其他同1.3.1。

1.3.4    低溫冷冻干燥粉碎预处理和提取    将200 g样品置于破壁机中进行研磨粉碎。过40目筛后取粉碎后的党参样品4份，每份5 g，并加水100 mL。沸水浴提取2.5 h，其他处理同1.3.1。经试验确定，该方法为最佳预处理方法。

1.4   低温冷冻干燥粉碎处理不同提取方法提取党参多糖

1.4.1   热水提取    同1.3.4。

1.4.2    酒精提取    取党参粉末样品4份，每份5 g，按1.3.4的方法处理。根据先前实验获得的最佳条件，加入100 mL的2%乙醇，在70 ℃下萃取2.5 h。收集滤液，并在相同条件下再次处理滤渣，合并滤液。其他处理同1.3.1。

1.4.3    碱提取    取党参粉末样品4份，每份5 g，按1.3.4的方法进行处理。根据先前实验获得的最佳条件，加入100 mL的1%氨溶液，并通过微煮沸提取2.5 h。收集滤液，并在相同条件下再次提取滤渣。合并滤液。其他处理同1.3.1。

1.4.4    超声波结合酶提取    取党参粉末样品4份，每份5 g，按1.3.4的方法进行处理。根据先前实验获得的最佳条件，加水100 mL、复合纤维素酶0.03 g，果胶酶0.01 g、木瓜蛋白酶0.03 g，超声提取1 h，收集滤液，相同的条件下再次萃取滤渣，将滤液合并。其他处理同1.3.1。

1.4.5    微波萃取    取党参粉末样品4份，每份5 g，按1.3.4的方法进行处理。根据先前实验获得的最佳条件，加水100 mL，在微波炉中低火（150 W）下提取15 min，收集滤液，并在相同条件下再次提取滤渣，合并滤液。其他处理同1.3.1。

1.5   分析方法

1.5.1    高效液相色谱法的检测多糖    液相色谱法用于检测并分析样品中的多糖。色谱条件：Ultra-hydrogel TM 250 GPC色谱柱，氢气流量7.8 mL/min，流动相为纯净水，柱温为30 ℃，流速为0.6 mL/min，注射量为20 μL，检测器是示差检测器。

1.5.2    样品溶液制备    取试验样品（党参多糖提取物）1 g，用去离子水定容至100 mL。摇匀并过滤，取滤液5 mL，加入无水乙醇20 mL。静置5 min，然后5 000 r/min下离心15 min。除去上清液，用80%乙醇洗涤沉淀1次。将沉淀物用去离子水定容至5 mL，作为测试样品溶液，过0.45 μm的水相针式过滤器，上机。

1.5.3   多糖粗产量的计算    粗产量=（党参提取物的重量/党参称样量）×100%。

采用分光光度法，以葡萄糖为标准样品绘制标准曲线，计算多糖含量。

多糖产率=（粗产量×多糖含量）/100%。

2   结果与分析

2.1   不同预处理方法对党参多糖提取效果的影响

从表1可以看出，与直接提取相比，浸泡预处理和微波预处理提取的粗产物，多糖含量和产率变化不大。也就是说，浸泡预处理和微波预处理对党参多糖的提取效果没有明显影响。低温冷冻干燥粉碎预处理可以大大提高提取物中的党参多糖含量和多糖产量，相比直接提取，多糖含量和产率分别提高了14.00%、49.58%。

2.2   低温冷冻干燥粉碎处理不同提取方法对党参多糖提取的影响

从表2可以看出，通过低温冷冻干燥粉碎预处理与碱提取相结合提取的党参多糖产率最高，为8.31%。与粗粉碎后直接热水提取相比，粗产物提高了44.74%，多糖含量提高了61.32%，多糖产量提高了133.43%;与传统的热水提取方法相比，低温冷冻干燥粉碎预处理结合乙醇提取、超声波结合酶法提取、微波提取对党参多糖提取率无明显改善。超声波结合酶提取和微波萃取甚至引起多糖含量下降，可能是因为处理条件没有达到最佳。

2.3   党参多糖的液相色谱

从图1可以看出，通过低温冷冻干燥粉碎预处理与热水提取相结合提取的多糖物质的峰形特征（b）接近直接提取（a）。峰出现时间和峰面积比例相似，总峰面积b > a。据推测，可能是低温冷冻干燥粉碎预处理后热水提取改善了党参多糖的总含量。在有提取物的前提下，与直接提取相比，提取的多糖类型和比例没有明显变化，从而改善了党参多糖的产量，使提取更充分和完整。低温冷冻干燥粉碎预处理与碱提取相结合提取的多糖特征谱（c）与直接提取相比变化较大，峰形明显变化，表明提取的党参多糖改变了性质。

3   结论和讨论

通过浸泡、微波、低温冷冻干燥粉碎等预处理方法，对党参多糖提取结果进行了对比，其中低温冷冻干燥粉碎可以极大地提高党参多糖的提取率，与烘干粉碎后直接提取相比，多糖含量和产率分别提高了14.00%、49.58%。采用低温冷冻干燥粉碎预处理结合碱提法，较常规热水提取可使党参粗产量、多糖含量、多糖产率分别提高44.74%、61.32%、133.43%。比较分析特征光谱通过不同处理获得的党参提取物中的多糖，发现低温冷冻干燥粉碎预处理主要提高了党参多糖的总含量，在提取物中，使得多糖产量增加和提取足够，提高了多糖的提取率，但它对提取的多糖类型及其比例影响不大。

低温冷冻干燥粉碎预处理可以大大改善党参多糖的提取效果，但很少影响提取的多糖的性质。可以推测，低温冷冻干燥粉碎预处理主要破坏党参组织使其结构松散易于粉碎成粉末状，使细胞内功能物质的溶解更加完整，这将在随后的实验中进行研究。

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（本文责编：陈    伟）