桂枝茯苓丸对子宫肌瘤模型大鼠的作用机制

陈智昌 潘春梅 郭虹

摘要 目的：评价桂枝茯苓丸对子宫肌瘤模型大鼠的療效，同时观察其对子宫组织病理及PI3K-AKT信号通路的作用。方法：选取90只雌性SD大鼠并随机分为空白组、模型组及中药组，每组30只。模型组及中药组大鼠进行苯甲酸雌二醇注射液腹腔注射模拟子宫肌瘤模型，空白组大鼠接受等剂量生理盐水腹腔注射，造模成功后中药组大鼠进行桂枝茯苓丸灌胃，空白组及模型组大鼠接受等剂量生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃18 d。比较各组大鼠子宫湿重、子宫系数、子宫平滑肌层厚度变化，用Masson染色比对各组大鼠子宫组织病理的变化，用Western blotting检测子宫组织PI3K、AKT、p-AKT水平的变化，免疫组织化学法检测各组雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）的表达。结果：与空白组比较，模型组及中药组的子宫湿重、子宫系数及子宫平滑肌层厚度明显增加，中药组上述指标明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;Masson染色显示空白对照组子宫组织切片着色为红色，极少量染色纤维组织;模型组大鼠子宫环行肌和纵行肌可见大量的深蓝色纤维组织，甚至部分肌层组出现明显的团块状纤维结构;中药组大鼠子宫组织的纤维化程度明显受到抑制。与空白组比较，模型组及中药组大鼠子宫组织的PI3K、p-AKT水平上调，T-AKT各组水平差异无统计学意义（P>0.05），其中中药组PI3K、p-AKT水平较模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组比较，模型组及中药组子宫平滑肌ER及PR阳性表达率升高，其中中药组低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：桂枝茯苓丸可明显抑制子宫肌瘤的发生发展，其作用机制可能是通过PI3K-AKT信号通路介导孕激素/雌激素受体实现的。

关键词 子宫肌瘤模型;大鼠;桂枝茯苓丸;病理变化;PI3K-AKT;信号通路

Abstract Objective：To evaluate the effects of Guizhi Fuling Pills（GZFP）on uterine fibroids in rats，and to observe its effect on uterine histopathology and PI3K-AKT signaling pathway.Methods：A total of 90 female SD rats were randomly divided into a blank group，a model group and a Chinese medicine group，with 30 rats in each group.Rats in the model group and the Chinese medicine group were intraperitoneally injected with estradiol benzoate to simulate uterine leiomyoma model.Rats in blank group were injected intraperitoneally with the same dose of normal saline.Rats in the Chinese medicine group were given GZFP intragastric administration after successful modeling.Rats in the blank group and the model group were given the same dose of normal saline intragastric administration once a day，for continuous 18 d.The changes of uterine wet weight，uterine coefficient and thickness of uterine smooth muscle layer were compared in each group.The pathological changes of uterine tissues were compared by Masson staining.The concentrations of PI3K，AKT and p-AKT in uterine tissues were detected by Western blotting.The estrogen receptor（ER）and progesterone receptor（PR）were detected by immunohistochemistry.Results： 1）Compared with the blank group，the wet weight of uterus，the coefficient of uterus and the thickness of smooth muscle layer of uterus in the model group and the Chinese medicine group were significantly increased，and the above indexes in the Chinese medicine group were significantly lower than those in the model group.The difference was statistically significant（P<0.05）. 2）Masson staining showed that in the blank control group，uterus tissue slices were red and few.In the model group，a large number of dark blue fibrous tissue could be seen in the uterine circular and longitudinal muscles，and even some of the myometrial groups had obvious lumpy fibrous structure. 3）Compared with the blank group，the concentrations of PI3K and p-AKT in the uterus of the model group and the Chinese medicine group were up-regulated.There was no significant difference in the concentrations of T-AKT among the three groups（P>0.05）.The concentrations of PI3K and p-AKT in the Chinese medicine group were significantly lower than those in the model group（P<0.05）. 4）Compared with the blank group，the positive expression rate of ER and PR in uterine smooth muscle of the model group and the Chinese medicine group increased，and the expression rate of ER and PR in the Chinese medicine group was lower than that in the model group.The difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：GZFP can significantly inhibit the occurrence and development of uterine leiomyoma，and its mechanism may be mediated by PI3K-AKT signaling pathway progesterone/estrogen receptor.

Key Words Uterine fibroids model; Rats; Guizhi Fuling Pills; Pathological changes; PI3K-AKT; Signaling pathway

中图分类号：R289.5;R711文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.018

子宫肌瘤是临床常见的妇科良性肿瘤，主要以下腹部疼痛、坠胀、子宫异常出血等为临床表现，对妇女生育产生了不良的影响，甚至有部分患者因治疗不及时而导致恶性病变[1-2]。目前子宫肌瘤的发病机制尚无统一定论，有研究认为子宫肌瘤是机体激素水平紊乱的产物[3]，有学者发现子宫肌瘤患者外周血清雌孕激素的水平与正常人群水平相仿，但雌孕激素受体的表达量明显升高，由此降低雌孕激素受体的水平可能是治疗子宫肌瘤的靶向[4-5]。此外，还有学者认为与细胞增殖/凋亡失常、细胞信号传导异常等因素有关，经典PI3K/AKT信号通路与激素受体调控机制关系密切，有研究显示，激活PI3K/AKT信号通路可增强子宫肌瘤细胞的侵袭力，导致病情恶化[6]。

桂枝茯苓丸首载于《金匮要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁组成，是治疗妇人癥病下血的经典方，自宋代以来该汤剂的运用范围逐渐扩展，大量运用于妇科经、带、产、杂等血瘀诸证[7-8]，临床不乏其有效治疗子宫肌瘤的报道[9-10]，但其作用机制尚不明确。基于此，我们探讨桂枝茯苓丸的作用机制是否与雌孕激素受体及其重要调控通路PI3K-AKT有关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取90只雌性SD大鼠，鼠龄3～6个月，平均鼠龄（4.5±0.3）个月。购自凯学生物科技（上海）有限公司，注册号：91310120MA1HK1JC5H。所有动物均由河南省实验动物中心饲养，饲养环境设置参数：温度（24±0.5）℃，湿度（52±0.5）%。

1.1.2 药物

苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀药业有限公司，国药准字H12020529）、桂枝茯苓丸（山西华康药业股份有限公司，国药准字030225Z56）。

1.1.3 试剂与仪器

全自动生化仪（AU5800，购自美国贝克曼库尔特公司）;雌激素受体一抗抗体（货号ab2847，购自Abcam有限公司）;β-actin一抗抗体（货号ab8226，购自Abcam有限公司），孕激素受体一抗抗体（货号ab3823，购自Abcam有限公司）;PI3K一抗抗体（货号ab2835，购自Abcam有限公司）;p-AKT一抗抗体（货号ab4812，购自Abcam有限公司）;t-AKT一抗抗体（货号ab5362，购自Abcam有限公司）。桂枝茯苓丸（山西华康药业股份有限公司，国药准字030225Z56）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

选取90只大鼠并采用数字随机法分为空白组、模型组及中药组，每组30只。各组大鼠在体质量、鼠龄各方面差异无统计学意义（P>0.05）。可进行组间比较。

模型制备：参考文献[11]中模型制备方法，具体如下：隔天（周一、周三、周五）对模型组及中药组大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mg/kg），连续注射12周，空白组大鼠接受相同时间，等剂量的生理盐水腹腔注射。

1.2.2 干预方法

至第13周开始药物干预，中药组接受桂枝茯苓丸灌胃（根据人临床用量换算成1.32 g/mL），其中空白组及模型组大鼠接受等剂量生理盐水灌胃，各组均1次/d，连续灌胃18 d。

1.2.3 检测指标与方法

子宫湿度及子宫系数：按照参考文献[12]的测量方法对各组大鼠子宫湿度及系数进行计算，具体如下：连续灌胃15 d后从各组大鼠随机选取6只大鼠，称重后麻醉断头处死后取出子宫，称得子宫的重量即子宫湿重;子宫系数=子宫（g）/大鼠体质量（g）。

子宫平滑肌厚度变化：干预结束后随机从各组选取6只大鼠，用10%多聚甲醛灌流固定，随后将子宫组织取出进行乙醇、二甲苯脱水，石蜡包埋成块，修片切片，染色，封片，光镜下观察，图像采集。每个样本随机取5个视野进行拍片观察，计算平滑肌层厚度，并计算平均值为最终结果。

Masson染色病理分析：将所得标本切片进行Masson染色，并参照文献[12]对标本病理进行分级，具体如下：0级：子宫平滑肌细胞排列整齐，结构清晰，未出现纤维组织增生，平滑肌细胞核呈红色，未出现或极少量组织呈蓝色条索状排列。腺体上皮细胞均呈单层立方或柱状排列;Ⅰ级：子宫平滑肌细胞尚属规则，平滑肌层轻度增生，平滑肌细胞核呈深红色或深蓝色，可见少量深蓝色网状结构组织;Ⅱ级：子宫平滑肌层出现部分增厚，大量平滑肌出现穿插现象，细胞排列紊乱，平滑肌细胞核呈深红色或深蓝色，可见较多深蓝色网状结构组织，腺体上皮细胞均呈单层或复层立方或柱状排列;Ⅲ级：子宫平滑肌层出现明显增厚，平滑肌穿插现象明显，甚至部分肌层出现旋涡状，细胞排列紊乱，平滑肌细胞核呈深红色或深蓝色，可见大量深蓝色网状结构组织。每个样本随机取5个视野进行拍片观察，观察病理分级情况，并计算平均值为最终结果。

Western Blotting檢测：干预结束后各组随机选取6只大鼠断头后取出子宫组织，称重后以1∶100比例加入裂解液对组织进行充分裂解，随后将充分裂解的样本在4 ℃ 12 000 r/min条件下进行离心后吸取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白水平测定，将样本加入事先配制好的电泳凝胶内，进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗后取出生物膜，加入ECL显影液进行显影，在凝胶成像系统中对显影结果进行采集及分析。

免疫组织化学检测法：干预结束后随机抓取各组6只大鼠腹腔注入10%水合氯醛充分麻醉，随后用多聚甲醛进行固定，取出子宫组织后再进行脱水、包埋、切片、固定，随后将切好的组织片进行脱蜡，在进行抗原修复、加入内源性过氧化物酶阻断剂，随后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，避光环境下加入DAB溶液进行显色，调整显色时间后用自来水将DAB溶液冲洗干净，封片，显微镜下读片，每张载玻片随机选择5个视野进行观察并计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析研究数据。计量资料用均数±标准（±s）表示，组间比较采用两样本t检验或两样本秩和检验;组内比较采用配对t检验或配对秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫湿重、子宫系数及子宫平滑肌层厚度的比较 与空白组比较，模型组及中药组的子宫湿重、子宫系数及子宫平滑肌层厚度明显增加，中药组上述指标明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组子宫病理表现 Masson染色显示空白对照组子宫组织切片着色为红色，极少量染色纤维组织;模型组大鼠子宫环行肌和纵行肌可见大量的深蓝色纤维组织，甚至部分肌层组出现明显的团块状纤维结构;中药组大鼠子宫组织的纤维化程度明显受到抑制。见图1。

2.3 各组大鼠子宫组织PI3K-AKT信号通路的改变 与空白组比较，模型组及中药组大鼠子宫组织的PI3K、p-AKT水平上调，T-AKT各组水平差异无统计学意义（P>0.05），其中中药组PI3K、p-AKT水平较模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表2。

2.4 各组子宫平滑肌ER及PR表达情况 与空白组比较，模型组及中药组子宫平滑肌ER及PR阳性表达率升高，其中中药组低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表3。

3 讨论

子宫肌瘤虽为良性肿瘤，但仍有恶变的可能。中医将子宫肌瘤归纳为“癥瘕”等范畴，寒邪入侵机体阻滞胞络，随着肾气日渐虚弱、冲任失调最终导致阴阳失衡，随后产生肝腑失调，气血运行不暢而出现凝滞瘀积于胞宫而成此病[14-15]，进而出现下腹部疼痛、坠胀、子宫异常出血等临床症状，由此温中散寒、活血化瘀通络是在治疗子宫肌瘤的关键。桂枝茯苓丸由张仲景在《伤寒论》中所创，方中桂枝性温味辛，以其温中散寒、祛瘀通络之功而为君药;桃仁有活血化瘀之功，可助桂枝行瘀滞化癥结，为臣药;牡丹皮和赤芍性微寒味苦，即可活血化瘀有可清热凉血，此外芍药还可缓急止痛，以缓解临床腹部不适之感;茯苓甘淡平，可渗湿健脾以化痰，以增强消瘤散结之功，此外茯苓可健脾益胃，益气生血以扶正;上述3药共为佐药。诸药合用共奏活血化瘀、温通经脉、缓消癥结之功，整方寒温并用，即可活血化瘀又无耗伤阴血之弊，祛瘀而不伤正[16-18]。本研究将SD雌性大鼠随机分为3组，利用苯甲酸雌二醇注射液腹腔注射模拟子宫肌瘤病理，连续用桂枝茯苓丸灌胃后发现大鼠子宫湿重及子宫平滑肌厚度确有所减少，且通过Masson染色证实桂枝茯苓丸可明显改善子宫肌瘤模型大鼠的病理等级，进一步佐证了桂枝茯苓丸对子宫肌瘤确有理想的疗效。

近年来，关于桂枝茯苓丸有效治疗子宫肌瘤的报道较多，但对其作用机制目前仍尚无结论。大量的资料发现当孕激素水平减少或雌激素作用被拮抗时，孕激素诱导子宫肌瘤细胞增殖的作用将被削弱，由此提示孕激素和雌激素在子宫肌瘤发生发展过程中有同等重要作用，宫内膜的异常增殖导致ER、PR的异常活化，而PR、ER表达增多可进一步诱导激素应答细胞信号传递，导致子宫内膜细胞异常增殖、分化，加速子宫肌瘤细胞的有丝分裂[19-20]。本研究发现PR、ER在造模组大鼠子宫组织中高表达，随着桂枝茯苓丸的干预，大鼠PR、ER表达均有所下降，由此我们认为桂枝茯苓丸治疗子宫肌瘤有效的作用机制可能是纠正孕激素和雌激素异常激活有关。ER表达的调控因素复杂多样，大量信号通路可通过转录、翻译、剪切等修饰手段对ER的表达产生影响，其中PI3K/Akt通路备受关注。PI3K/Akt信号通路被视为介导肿瘤细胞活动的重要机制，P13K受到生长因子等活化后将其下游磷脂酰肌醇催化成二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇，二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇均是细胞重要的第二信使因子，激活后进一步活化下游的蛋白激酶Akt，介导各种生物学效应，从而导致各种疾病（糖尿病、自身免疫疾病和肿瘤等）的发生[21-22]。本研究显示，与空白组比较，模型组及中药组大鼠子宫组织的PI3K、p-AKT水平上调，其中中药组PI3K、p-AKT水平较模型组明显降低，提示桂枝茯苓丸治疗子宫肌瘤有效的作用机制可能是通过介导PI3K/Akt通路实现的。

总之，桂枝茯苓丸可明显抑制子宫肌瘤的发生发展，其作用机制可能是通过PI3K-AKT信号通路介导孕激素/雌激素受体实现的。

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（2019-02-21收稿 责任编辑：杨觉雄）