低温条件下海水暂养装置脱氮系统的构建及其应用效果

兰燕月 张饮江 宋增福 吴圣哲 徐成龙 赵志淼

摘要：【目的】设计一种可有效降低海水暂养循环系统中氮浓度的新型脱氮技术工艺，提高鲜活海产品的暂养存活率，以确保健康安全海产品的流通及满足人们的膳食需求。【方法】针对暂养水体温度低、碳氮比低及溶解氧高等特点，采用农业废弃物玉米芯作为碳源和生物膜载体，通过驯化低温脱氮菌（硝化菌和反硝化菌）并结合人工强化挂膜方式建立同步硝化反硝化脱氮系统。【结果】经低温、高盐驯化富集培养的硝化菌富集液和反硝化菌富集液均以变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主，但在纲水平上，硝化菌富集液中以γ­变形菌纲（Gammaproteobacteria）和α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）为主，其相对丰度分别为83.50%和12.90%，而在反硝化菌富集液中γ­变形菌纲为主要纲，其相对丰度为91.30%。通过电镜扫描发现，置于脱氮反应器内的玉米芯表层有微生物膜覆盖，其表层孔隙数量明显减少;玉米芯还作为固相碳源，促使反硝化过程持续进行。玉米芯脱氮反应器装置运行60 d内，出水口水样的总氮、氨氮和硝氮去除率均隨时间推移呈先升高后降低的变化趋势，最高去除率分别达（63.46±0.55）%、（62.79±0.52）%和（65.00±0.63）%。【结论】以玉米芯为碳源和生物膜载体、利用人工强化挂膜构建的玉米芯脱氮反应器装置能同步实现硝化反硝化过程，脱氮效果佳且可保证系统长期运行，还具有构建工艺简单、体积小及成本低等特点，适用于大部分海产品低温暂养系统。

关键词： 海水暂养循环系统;低温;玉米芯;同步硝化反硝化;脱氮效果

中图分类号： S983.022                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）08-1836-08

Construction and application of denitrification system of seawater temporary nutrition system at low temperature

LAN Yan-yue1， ZHANG Yin-jiang1，2*， SONG Zeng-fu3，4， WU Sheng-zhe5，

XU Cheng-long1， ZHAO Zhi-miao1

（1College of Marine Ecology and Environment， Shanghai Ocean University， Shanghai  201306， China; 2Engineering Research Center for Water Environment Ecology in Shanghai， Shanghai  201306， China; 3College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai  201306， China; 4National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals（Shanghai Ocean University）， Shanghai  201306， China; 5Fuzhou Xinhengzhi Aquarium & Equipment Co.，Ltd.， Fuzhou  350000， China）

Abstract：【Objective】To design a new denitrification technology which could effectively reduce the nitrogen concentration in the seawater temporary nutrient circulation system and improve the temporary survival rate of fresh seafood， so as to ensure the circulation of healthy and safe seafood and continuously meet people’s dietary needs. 【Method】In view of the characteristics of low temperature， low C/N ratio and high dissolved oxygen in temporary water， corn cob was used as carbon source and biofilm carrier to establish simultaneous nitrification and denitrification system by domesticating low-temperature denitrifying bacteria（nitrifying bacteria and denitrifying bacteria） combined with artificial enhanced film-hanging. 【Result】Proteobacteria and Bacteroidetes were the main components of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria enrichment solution after acclimation at low temperature and high salinity， but gammaproteobacteria and alphaproteobacteria were the main components of nitrifying bacteria enrichment solution at class level， and their relative abundances were 83.50% and 12.90% respectively. The relative abundance of gammaproteobacteria in denitrifying bacteria enrichment solution was 91.30%. By scanning electron microscopy， it was found that microbial membrane covered the surface of corn cob in denitrification reactor， and the number of pore in the surface decreased greatly. Corn cob was also used as so-lid carbon source to promote denitrification. Within 60 d of operation of corn cob denitrification reactor， the removal rates of total nitrogen， ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in outlet water increased first and then decreased with time. The highest removal rates were（63.46±0.55）%， （62.79±0.52）% and （65.00±0.63）% respectively. 【Conclusion】Corn cob denitrification reactor with corn cob as carbon source and biofilm carrier and artificial strengthening film formation can realize simultaneous nitrification and denitrification process. The effect of denitrification is good and the system can run for a long time. It also has the characteristics of simple construction process， small size and low cost. It is suitable for most marine products temporary maintenance system.

Key words： seawater temporary nutrition circulation system; low temperature; corn cob; simultaneous nitrification and denitrification; denitrification effect

0 引言

【研究意义】近年来，随着人们生活水平的不断提高，市场对鲜活海产品的需求量也逐年增长（孙娟和杨德利，2011;李湘江等，2018）。由于传统海水暂养系统的水体循环不合理、过滤器效果差，且缺乏专门的脱氮设备，导致海产品存活率低的问题仍然制约着鲜活海产品运输、销售等产业链的延伸与发展（何蓉和谢晶，2012;Yang et al.，2012;徐子涵和茅林春，2018），因此，科学改进低温条件下的海水暂养系统以提高鲜活海产品存活率及其品质迫在眉睫。【前人研究进展】传统的养殖水体处理工艺主要关注氨氮和亚硝态氮去除效果（李玲和楚国生，2010;李梅，2017;李冬梅等，2018），而忽略硝酸盐积累对水产品造成的危害。Heather等（2008）、van Bussel等（2012）研究表明，在高浓度的硝酸盐条件下，水生动物组织发育减缓、激素分泌功能下降、生理机能变弱，甚至死亡。Kuhn等（2010）研究表明，硝酸盐的累积能明显抑制虾类存活率，并引发胰腺病变，降低产量。目前，提高鲜活海产品存活率的手段主要是采取低温暂养。低温暂养可有效保证海产品的鲜活度（何登菊等，2010;王荣业，2018），尤其是低温高湿环境能降低其代谢水平，而有利于提高鲜活海产品的存活率（张饮江等，2005）;但低温条件下脱氮微生物难以富集，导致暂养系统的水质较差（Shapovalova et al.，2008）。因此，富集培养耐盐、耐低温的脱氮菌及合理构建脱氮系统是解决传统海水暂养系统海产品存活率问题的关键。Larsen等（2015）研究表明，将水温降至15 ℃能有效提高美国牡蛎的存活效果，且降低副溶血性弧菌和创伤弧菌的感染风险。王振华等（2015）研究发现，水温以1 ℃/h的速度降至应激温度[（14.3±0.8）℃]时，吉富罗非鱼的血糖、肌糖原和乳酸水平均呈上升趋势，其中肌糖原上升趋势最明显;低温应激影响在24 h后通过罗非鱼自身调整消除，各生理生化指标最终趋于稳定。潘澜澜等（2017）研究发现，净化暂养循环水系统与低温离水保活相结合能有效延长虾夷扇贝的保活时间并提高其品质。贾晋和贾涛（2018）针对国内小龙虾市场供不应求的现状，自主研发了一套低温暂养循环水系统，有效解决了小龙虾车载运输及车间长期暂养的问题。【本研究切入点】综上所述，如何优化海水暂养系统水体循环，实现低温脱氮效果的同时保证海产品存活率，且经济有效是构建海产品活体循环暂养系统亟待解决的关键问题（黄啸和陆茵，2010;张成林等，2016），但目前鲜见低温条件下海水暂养装置脱氮系统构建及其应用的相关研究报道。【拟解决的关键问题】针对暂养水体温度低、碳氮比低及溶解氧高等特点，采用农业废弃物玉米芯作为碳源和生物膜载体，通过驯化低温脱氮菌（硝化菌和反硝化菌）并结合人工强化挂膜方式建立同步硝化反硝化脱氮系统，最终设计出一种可有效降低海水暂养循环系统中氮浓度的新型脱氮技术工艺，旨在提高鲜活海产品的暂养存活率，确保健康安全海产品的流通及满足人们的膳食需求。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

硝化菌样品于2018年3月采自上海海洋大学海参循环水养殖系统，水温15.0 ℃。反硝化菌样品采自上海海洋大学滨海基地池塘养殖底泥，4 ℃保存备用。玉米芯取自上海市宝山区罗南镇罗南新村农田，以蒸馏水浸泡4 h过滤清洗后，置于鼓风干燥箱中50.0 ℃干燥12 h，取出置于干燥器中保存备用。参照常规海产品循环暂养系统的水质指标（表1），以海水晶配制人工海水（盐度25.00‰～27.00‰），添加适量硝酸钾、硫酸铵和磷酸二氢钾后即获得试验用养殖海水。

1. 2 硝化菌和反硝化菌驯化富集培养

硝化菌与反硝化菌驯化富集培养装置见图1。硝化菌驯化：取500 mL水样放入5 L锥形瓶中，加入4 L改良Stephenson硝化菌培养液，以氯化钠调整盐度至（25.00±0.50）‰，碳酸氢钠溶液调节pH 7.0～7.5，充氧并搅拌，溶解氧含量保持在4 mg/L以上，15.0 ℃恒温驯化培养60 d（郑林雪等，2015;刘洋等，2017）。反硝化菌驯化：取適量底泥样品放入5 L锥形瓶中，加入4 L反硝化菌培养液（硝酸钾2.00 g/L，柠檬酸钠5.00 g/L，磷酸氢二钠1.00 g/L，硫酸镁0.02 g/L，磷酸氢二钾1.00 g/L），厌氧驯化培养15 d。

1. 3 人工强化挂膜

成功驯化富集培养硝化菌和反硝化菌后，取适量反硝化菌液置于10 L玻璃容器中，参考邵留等（2018）的人工强化挂膜方式，将玉米芯投放至反硝化菌液中充分浸泡3 d，温度保持在15.0 ℃，然后将驯化富集培养好的硝化菌用喷壶均匀喷洒在已浸泡过反硝化菌的玉米芯柱外层。采用扫描电镜法对玉米芯载体表面生物挂膜情况及生膜表面形态进行观察分析。

1. 4 同步硝化反硝化脱氮系统构建

同步硝化反硝化脱氮系统即玉米芯脱氮反应器装置（图2），玉米芯柱置于反应器内，反应器（底部直径24 cm，高26 cm）为PVC材质，分别设有进水口和出水口，进水口和出水口距反应器底部高度分别为3和23 cm。将经人工强化挂膜的玉米芯（干重1 kg）置于过筛孔径2 cm的网箱内塑成柱状，垂直固定于反应器内。试验模拟循环暂养水由储水池经蠕动泵推流进入反应器，控制流速为15.00±0.24 mL/min，反应器内温度保持在（15.0±0.2）℃，设3组平行装置。

1. 5 微生物群落结构分析

微生物群落结构采用16S rRNA基因文库进行分析，取混合样品，每个样品10 mL，以干冰冻存后24 h内完成检测。硝化菌液高通量测序采用细菌通用引物（5'-CARTGYCAYGTBGARTA-3'和5'-TWN GGCATRTGRCARTC-3'），反硝化菌液高通量测序采用nrfA引物（5'-CARTGYCAYGTBGARTA-3'和5'-TWNGGCATRTGRCARTC-3'）。具体技术路线（潘彦硕等，2018;佟延南等，2018）：微生物组总DNA提取→目标片段PCR扩增→扩增产物回收纯化→扩增产物荧光定量→测序文库制备→上机进行高通量测序。依据高通量测序所得数据分析菌种多样性水平及样本菌群的代谢功能。

1. 6 水质检测方法

玉米芯脱氮反应器装置运行60 d，期间每2 d采集1次进水口和出水口的水样。总氮采用过硫酸钾氧化法测定，氨氮采用次溴酸盐氧化法测定，硝氮采用锌—铬还原法测定，总有机碳（TOC）采用总有机碳分析仪（TOC-L，日本岛津）进行测定，pH和水温采用多参数水质分析仪进行检测。

1. 7 统计分析

试验数据采用Excel 2013和SPSS 20.0进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 硝化菌和反硝化菌的驯化富集情况

利用微生物驯化富集培养装置，在低温条件下将硝化菌和反硝化菌分别驯化富集培养60和15 d后，硝化菌液和反硝化菌液各取2个平行样品。利用微生物高通量测序技术对富集液内的微生物群落结构进行检测分析，经低温、高盐度驯化富集培养的硝化菌富集液和反硝化菌富集液在各分类水平下的微生物类群数量如表2所示。在门水平上，硝化菌富集液、反硝化菌富集液的优势菌群均以变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主，对应的相对丰度分别为95.76%和2.70%、95.21%和3.54%。在纲水平上，硝化菌富集液中以γ­变形菌纲（Gammaproteobacteria）和α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）为主（图3-A），其相对丰度分别为83.50%和12.90%;而在反硝化菌富集液中以γ­变形菌纲为主要纲（图3-B），其相对丰度为91.30%。

2. 2 微生物膜表观结构的电镜扫描结果

使用反硝化菌液浸泡玉米芯3 d后，再将硝化菌液喷洒于玉米芯表层，肉眼观察玉米芯表面附着有透明水状膜。通过电镜对玉米芯表面生物膜的附着情况及其表面形态进行扫描分析，结果显示，玉米芯经人工强化挂膜后其表层孔隙数量明显减少（图4-A和图4-B），即减少的孔隙可能已被微生物所附着;而未挂膜的玉米芯表层呈蜂窝状，孔隙数较多（图4-C和图4-D）。

2. 3 玉米芯脱氮反应器的脱氮效果

试验期间玉米芯脱氮反应器装置出水口水样的总氮、氨氮、硝氮浓度及其去除率变化情况分别如图5-A、图5-B和图5-C所示。经人工强化挂膜，玉米芯脱氮反应器运行2 d后，循环水样的总氮、氨氮和硝氮去除率分别为（54.03±0.41）%、（46.56±0.32）%和（56.60±0.40）%。在整个试验期间，总氮去除率随时间推移呈先升高后降低的变化趋势，最高可达（63.46±0.55）%，试验后期去除率降低的原因是微生物数量减少所致。玉米芯脱氮反应器装置运行期间，氨氮、硝氮的去除率最高可达（62.79±0.52）%和（65.00±0.63）%，其变化趋势与总氮基本一致，说明经低温、高盐驯化富集培养的硝化菌和反硝化菌在玉米芯脱氮反应器装置系统内具有良好的适应性。

试验前、中期循环水样的总氮、氨氮和硝氮均能保持相对稳定的去除率，基本维持在（45.00±0.33）%～（65.00±0.71）%;试验后期（≥45 d），总氮、氨氮和硝氮的去除率呈明显下降趋势。结合图5-D可看出，出水口水样TOC浓度下降明显，说明玉米芯内易分解有机物被大量消耗，反硝化碳源不断减少，从而导致总氮去除率下降;但硝氮去除率仍保持在（50.00±0.48）%～（42.00±0.34）%，可能是玉米芯此时又作为固相碳源，促使反硝化过程得以持续进行。

3 讨论

3. 1 微生物驯化富集培养与人工强化挂膜

目前，人们对海产品质量及水质量要求越来越高与暂养系统水处理效果较差的矛盾日益突出。本研究用于低温、高盐驯化富集培养的微生物种类是常用水处理菌群，且与多数同步硝化反硝化反应器细菌群落分布情况一致。Bae等（2010）研究发现，厌氧氨氧化生物反应器启动后其细菌群落结构中以变形菌门为主，占42.00%，且远高于浮霉菌门（Planctomycetes）的20.00%。李滨等（2012）通过分析稳定运行的UASB厌氧氨氧化反应器，也发现是变形菌门占据主导位置（41.90%）。本研究結果表明，硝化菌富集液、反硝化菌富集液的优势菌群均以变形菌门和拟杆菌门为主，但在纲水平上，硝化菌富集液中以γ­变形菌纲和α-变形杆菌纲为主，其相对丰度分别为83.50%和12.90%，而在反硝化菌富集液中γ­变形菌纲为主要纲，其相对丰度为91.30%。变形菌纲是一类分布广泛的环境微生物类群，可从海洋、超盐环境、碱性或酸性生境中分离获得。张现辉和孔凡晶（2010）研究表明，西藏扎布耶盐湖的细菌类群多样性主要分布在变形菌纲、拟杆菌纲（Bacteroidetes）、芽孢杆菌纲（Bacilli）和疣微菌纲（Verrucomicrobiae）中，尤其以变形菌纲为主。朱德锐等（2012）研究发现，青海湖湖域生境中的嗜盐微生物以γ-变形菌纲为优势类群，约占68.60%。可见，本研究通过低温、高盐驯化富集培养获得的菌群是适用于海水养殖水处理的菌种。

驯化富集培养的微生物菌群能利用玉米芯作为生物膜载体进行人工强化挂膜，而载体表面粗糙程度和孔隙度是影响微生物附着和生长的重要因素，因为附着载体比表面积和孔隙越大，与微生物可接触面积就越大，越有利于微生物附着（李华等，2016）。玉米芯作为生物膜附着载体应用于污水处理时，可间接增大与水体的接触面积，从而提高水体净化效率（陈涛等，2018;邵留等，2018）。从本研究中玉米芯挂膜前后的电镜扫描结果可知，玉米芯表层孔隙多且密集，非常有利于微生物附着。挂膜后的玉米芯表层孔隙明显减少，说明微生物在低温、高盐条件下挂膜情况良好。

3. 2 装置脱氮效果及其作用机理分析

玉米芯脱氮反应器装置运行期间，pH始终稳定在7.2～7.6，适宜于同步硝化反硝化的发生（邹联沛等，2001）。本研究以玉米芯作为载体，通过人工强化挂膜，使玉米芯内部附着反硝化菌、外部附着硝化菌，即实现同步硝化反硝化过程。邵留等（2018）利用玉米芯作为生物膜载体以去除罗非鱼养殖水体中的总氮，其去除效果良好，去除率达85%。本研究构建的玉米芯脱氮反应器装置在低温、高盐环境下可持续运行并保证较高的总氮去除效果[总氮去除率（63.46±0.55）%]，说明该装置可在低温、高盐条件下同步实现硝化反硝化脱氮，且能保持长期运行。玉米芯脱氮反应器装置运行40 d后，出水口水样的TOC浓度（约30 mg/L）进入稳定期，结合硝氮去除率的变化趋势可知，试验前、中期是以玉米芯所分解的有机物作为微生物反硝化碳源，从而促进脱氮（王芳等，2014;陈涛等，2018）;试验后期当水体中碳源含量较低时，玉米芯本身可作为固相碳源，释放出一定量的有机碳促进反硝化持续进行。在同步硝化反硝化的过程中，碳源含量直接影响脱氮效率（赵冰怡等，2009）。本研究利用可释放溶解性有机碳的玉米芯，经微生物菌液人工强化挂膜后将其置于反应器中用于处理海产品暂养污水，效果佳且可保证系统长期运行。此外，玉米芯表层附着的硝化菌需消耗大量进水溶解氧，导致扩散至玉米芯柱内部的溶解氧减少，促使玉米芯内部呈缺/厌氧环境，而有利于反硝化菌的生长与繁殖;当水体中碳源含量不足时，玉米芯所释放的有机碳源亦可保证反硝化过程顺利进行。

4 结论

以玉米芯为碳源和生物膜载体、利用人工强化挂膜构建的玉米芯脱氮反应器装置能同步实现硝化反硝化过程，脱氮效果佳且可保证系统长期运行，还具有构建工艺简单、体积小及成本低等特点，适用于大部分海产品低温暂养系统。

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（責任编辑 兰宗宝）