EBV感染与恶性淋巴瘤病人染色体异常、免疫表型及 预后的相关性

张长凯 郭小芳 卢伟 管洪在

[摘要]目的探讨EB病毒（EBV）感染与恶性淋巴瘤（ML）病人染色体异常和免疫表型的关系以及EBV对ML预后的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测150例ML病人（包括霍奇金淋巴瘤（HL）14例、非霍奇金淋巴瘤（NHL）136例）和37例正常人骨髓中的EBV-DNA拷贝数，应用R显带技术分析染色体核型，应用流式细胞仪（FCM）对ML进行免疫分型，并对部分病人进行临床随访。结果150例ML病人中59例检出EBV，阳性率为39.3%;37例正常人中2例检出EBV，阳性率为5.4%，ML病人EBV阳性率明显高于对照组（χ2=13.60，P<0.01）。FCM分型B-NHL病人和T-NHL病人EBV阳性率分别为36.4%（40/110）和38.5%（10/26），两者差异无显著性（χ2=0.04，P>0.05）。R显带核型分析显示，EBV阳性病人和EBV阴性病人染色体异常率分别为16.9%（10/59）和13.2%（12/91），染色体异常与EBV感染无显著相关性（χ2=0.16，P>0.05）。臨床随访显示，EBV阳性组和EBV阴性组2年内复发率分别为56.1%（23/41）和31.7%（20/63），病死率分别为24.4%（10/41）和3.2%（2/63），两组比较差异均有显著性（χ2=6.10、10.80，P<0.05）。结论EBV感染与ML病人免疫表型和染色体异常无关;EBV阳性ML病人复发率和病死率高，预后不良。

[关键词]淋巴瘤;方法，核型分析;疱疹病毒4型，人;实时聚合酶链反应;免疫表型分型

[中图分类号]R733.4;R373.9[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2019）03-0275-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the association of Epstein-Barr virus （EBV） infection with chromosomal abnormalities and immunophenotype in patients with malignant lymphoma （ML） and the influence of EBV on the prognosis of ML. Me-thodsQuantitative real-time PCR was used to measure the copy number of EBV-DNA in bone marrow from 150 patients with ML （14 patients with Hodgkin lymphoma （HL） and 136 patients with non-Hodgkin lymphoma （NHL）） and 37 healthy individuals. The R-banding technique was used to analyze karyotype， and flow cytometry （FCM） was used to determine the immunophenotype of ML patients. Clinical follow-up was performed for some patients. ResultsOf all 150 patients with ML， 59 had EBV infection， resulting in a positive rate of 39.3%; among the 37 healthy individuals， 2 were found to have EBV infection， resulting in a positive rate of 5.4%; the patients with ML had a significantly higher EBV positive rate than healthy individuals （χ2=13.60，P<0.01）. The 136 patients with NHL were divided into B-NHL group with 110 patients and T-NHL group with 26 patients according to FCM， and there was no significant difference in EBV positive rate between the two groups （36.4% （40/110） vs 38.5% （10/26）， χ2=0.04，P>0.05）. The R-banding technique showed a rate of chromosomal abnormalities of 16.9% （10/59） in EBV-positive patients and 13.2% （12/91） in EBV-negative patients， and there was no significant association between chromosome abnormality and EBV infection （χ2=0.16，P>0.05）. Clinical follow-up showed that there were significant differences between the EBV-positive patients and the EBV-negative patients in 2 year recurrence rate （56.1% （23/41） vs 31.7% （20/63）， χ2=6.10，P<0.05） and mortality rate （24.4% （10/41） vs 3.2% （2/63）， χ2=10.80，P<0.05）.ConclusionEBV infection is not associated with immunophenotype and chromosomal abnormalities in patients with ML， and EBV-positive ML patients tend to have high recurrence and mortality rates and poor prognosis.

[KEY WORDS]lymphomas; karyotyping; herpesvirus 4， human; real-time polymerase chain reaction; immunophenotyping

恶性淋巴瘤（ML）是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）两大类[1]。ML占全世界所有恶性肿瘤的3.37%，我国ML以NHL常见[2]，发病年龄多在20～40岁。ML的病因目前尚不清楚，病毒感染、染色体易位、癌基因激活及其蛋白产物的作用可能在淋巴瘤的发病中起重要作用。EB病毒（EBV）是一种人类4型疱疹病毒，在人群中普遍易感。EBV与伯基特淋巴瘤（BL）等多种疾病密切相关[3]，但关于EBV感染与ML染色体畸变和免疫表型的关系报道较少。因此，本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测EBV-DNA拷贝数来探讨EBV感染与ML免疫表型、染色体畸变以及预后的关系。

1资料和方法

1.1一般资料

研究对象均来自于青岛大学附属医院2013年1月1日—2017年12月31日收治的病人。实验组150例ML病人（包括136例NHL和14例HL），男72例，女78例;年龄15～79岁，中位年龄51岁。ML诊断符合2008年世界卫生组织造血及淋巴组织肿瘤分类的标准[1]。对照组37例为无任何血液系统疾病且骨髓常规正常的病人，男18例，女19例;年龄17～43岁，中位年龄43岁。

1.2标本采集及DNA提取

在无菌条件下采集研究对象的骨髓液2 mL，置于肝素抗凝管中。将标本离心去上清液后转移至15 mL离心管中，用PBS缓冲液洗涤3次，再加入SNET裂解液1 mL和0.1 g/L的蛋白酶K 35 μL，将离心管颠倒混合均匀，52 ℃消化2 h。采用常规苯酚-氯仿-异戊醇法提取骨髓细胞中的DNA，用核酸蛋白检测仪测定提取DNA的纯度和浓度。

1.3EBV-DNA扩增

EBV核酸扩增FQ-PCR检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）包含EBV-PCR反应液（引物序列见表1）、Tap酶、dNTPs、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品、EBV阳性定量标准品（包括107、108、109、1010copies/L，用以构建FQ-PCR标准曲线）。向PCR反应管（管中含有EBV-PCR反应液、Taq酶、dNTPs）中加入DNA模板2 μL，震荡混匀后再离心数秒，置于SLAN-96P荧光定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司）中扩增。PCR反应条件为：93 ℃预变性2 min;93 ℃、45 s，55 ℃、60 s，10个循环;93 ℃、30 s，55 ℃、45 s，30个循环。检测系统自动显示EBV核酸扩增的动力学曲线和标准曲线，所有标本均重复检测3次。检测下限为106copies/L，EBV-DNA拷贝数低于检测下限为EBV阴性。

1.4免疫分型

采用流式细胞仪（FCM）测定骨髓标本中细胞的免疫表型。参照2008年世界卫生组织的分类法对ML的免疫表型进行分析。采用CD45/侧向散射光强度（SSC）设门，分析10 000个细胞并计算细胞表面特定抗原的表达水平。B细胞标记抗原为CD10、CD19、CD20、CD23、cCD79a，T细胞标记抗原为CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8。抗原表达小于20%判定为阴性，抗原表达在20%～50%之间为可疑陽性，抗原表达超过50%为阳性[4]。Kappa/lambda比值大于3.0或小于0.5支持B-NHL[5-6]。CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8标记抗原阳性支持T-NHL。

1.5细胞遗传学分析

在ML特异性治疗前，应用R显带技术对培养24 h的骨髓细胞进行核型分析。每个样本分析10个中期细胞，核型根据国际人类细胞遗传学命名系统（2009）进行分类。

1.6统计学处理

应用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析连续变量是否服从正态分布，非正态分布计量资料的比较采用非参数检验;各组间EBV阳性率的比较采用χ2检验;EBV感染与ML病人复发率和病死率的关系分析采用Log-rank检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1ML病人EBV感染率

本文150例ML病人中59例检出EBV，阳性率为39.3%;37例正常人中2例检出EBV，阳性率为5.4%，ML病人的EBV阳性率明显高于对照组（χ2=13.60，P<0.01）。NHL和HL病人EBV阳性率分别为36.7%（50/136）和64.3%（9/14），HL病人EBV阳性率明显高于NHL病人（χ2=4.03，P<0.05）。

2.2EBV感染与NHL免疫分型

FCM免疫分型显示，136例NHL病人中，110例为B-NHL，26例为T-NHL。B-NHL和T-NHL病人EBV阳性率分别为36.4%（40/110）和38.5%（10/26），两者之间差异无统计学意义（χ2=0.04，P>0.05）。

2.3EBV感染与染色体异常

R显带核型分析显示，ML病人的染色体异常率为14.7%（22/150），染色体异常以复杂异常为主（指存在≥3个染色体畸变，包括至少1个结构畸变）。见表2。EBV阳性病人和EBV阴性病人染色体异常率分别为16.9%（10/59）和13.2%（12/91），染色体异常与EBV感染无显著相关性（χ2=0.16，P>0.05）。

2.4EBV感染与预后

截止到2017年12月31日，共随访到104例病人（EBV阳性41例，EBV阴性63例）。EBV阳性组和EBV阴性组2年内复发率分别为56.1%（23/41）和31.7%（20/63），病死率分别为24.4%（10/41）和3.2%（2/63），EBV阳性组的复发率和病死率明显高于EBV阴性组，差异均有显著意义（χ2=6.10、10.80，P<0.05）。在EBV阳性组中，死亡病人的EBV-DNA含量为0.60（2.08）×1010 copies/L，生存病人的EBV-DNA含量为1.83（1.71）×108copies/L，死亡病人的EBV-DNA含量显著高于生存病人（Z=4.76，P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，与EBV阴性病人相比，EBV阳性病人的生存期明显缩短（图1）。

与EBV阴性病人相比，EBV阳性病人的生存期显著缩短。

3讨论

流行病学研究表明，多种潜在危险因素与ML有关，其中最受关注的是免疫抑制和病毒感染，约15%的人类淋巴瘤与病毒感染（最常见的是EBV）有关[7]。有文献报道，90%以上的人建立了EBV终生潜伏感染状态[8]。研究已证明，EBV感染与传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、BL等多种疾病密切相关[9-10]。另有研究发现，EBV感染与ML的发生密切相关[11]。故本研究探讨了EBV感染与ML免疫分型、细胞遗传学异常及预后的关系。

本文研究结果显示，ML病人的EBV阳性率为39.3%，明显高于对照组，表明EBV感染与ML的发生密切相关。HL和NHL病人的EBV阳性率分别为64.3%和36.7%，HL病人EBV感染率显著高于NHL病人，这一结果与LIU等[12]的报道一致。与NHL相比，EBV感染与HL发病的关系更为密切。目前对于EBV的致瘤机制还不清楚，有两种可能途径：①EBV感染宿主细胞后，EBV基因整合到宿主基因组中[13]，使宿主基因组发生突变，引起肿瘤的发生;②EBV编码的产物促进肿瘤的发生，如EBV编码的LMP1是一种致瘤性潜伏膜蛋白，它能够抑制细胞DNA损伤修复[14]，激活PI3K/Akt通路及其他信号传导通路[15]。EBV在ML发病中的作用及其分子机制有待进一步研究。

EBV主要通过CD21和病毒糖蛋白gp350/220感染B细胞[16]，但有研究表明，EBV也可以感染T细胞、NK细胞和单核巨噬细胞[9]。为探讨EBV感染与NHL免疫分型的关系，本研究采用FCM对NHL进行免疫分型，结果显示，B-NHL和T-NHL病人的EBV阳性率分别为36.4%和38.5%，两者间差异无显著性，与ABADI等[17]的结果一致。上述结果表明，EBV感染可能与ML的免疫表型无关。

有关研究报道，大约90%的ML有染色体异常[18]，某些染色体异常与ML的组织学及免疫学亚型相关，如t（14;18）（q32;q21）见于滤泡性淋巴瘤，而t（3;22）（q27;q11）常见于弥漫性大B淋巴细胞瘤等。本研究ML病人的染色体异常率为14.7%，这一结果低于有关报道[18]。一方面，可能是因为本研究分析的是骨髓细胞，淋巴瘤细胞可能还没有浸润到骨髓中;另一方面，可能是因为常规的细胞遗传学分析无法检测到一些细微的染色体改变。最近有研究者利用荧光原位杂交（FISH）和分子遗传学技术观察到，EBV感染导致BL与鼻咽癌基因组的不稳定[19-21]。本文没有发现EBV感染与ML染色体异常相关的证据。因此，要想阐明EBV感染在ML相关染色体畸变中的作用，可能需要细胞遗传学结合FISH和分子生物学等技术进一步的研究。

苗红霞等[22]研究结果表明，EBV感染是急性淋巴细胞白血病预后不良因素。本研究结果显示，EBV阳性ML病人复发率及病死率高于EBV阴性ML病人，EBV阴性ML病人的生存时间长于EBV阳性的ML病人，EBV阳性ML病人的临床预后较差。GRYWALSKA等[23]研究表明，EBV-DNA的拷贝数与慢性淋巴细胞白血病不良預后有关。本研究结果也显示，在EBV阳性ML病人中，死亡病人的EBV-DNA拷贝数高于生存病人，EBV-DNA含量与ML不良预后有关，表明检测EBV-DNA含量对于评估病人病情及预后有重要意义。

总之，EBV感染参与了ML的发病过程并且与其预后不良有关，但对ML的免疫表型无影响，与ML的染色体异常也无明显相关性。EBV感染在ML发病中的作用及其分子机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1]SABATTINI E， BACCI F， SAGRAMOSO C， et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008：an overview[J].  Pathologica， 2010，102（3）：83-87.

[2]张玉玲，庹吉妤，郑荣寿，等. 中国2009年恶性淋巴瘤发病与死亡分析[J].  中国肿瘤， 2013，22（5）：338-343.

[3]DIEPSTRA A， VAN IMHOFF G W， SCHAAPVELD M A， et al. Latent Epstein-Barr virus infection of tumor cells in classical Hodgkin’s lymphoma predicts adverse outcome in older adult patients[J].  Journal of Clinical Oncology， 2009，27（23）：3815-3821.

[4]BOROWITZ M J， BRAY R， GASCOYNE R， et al. U.S.-Canadian consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematologic neoplasia by flow cytometry： data analysis and interpretation[J].  Cytometry， 1997，30（5）：236-244.

[5]DUNPHY C H. Combining morphology and flow cytometric immunophenotyping to evaluate bone marrow specimens for B-cell malignant neoplasms[J].  American Journal of Clinical Pathology， 1998，109（5）：625-630.

[6]RAVOET C， DEMARTIN S， GERARD R， et al. Contribution of flow cytometry to the diagnosis of malignant and non malignant conditions in lymph node biopsies[J].  Leukemia & Lymphoma， 2004，45（8）：1587-1593.

[7]黄治虎，陈宝安，欧阳建，等. 我国白血病流行病学调查的现状和对策[J].  临床血液学杂志， 2009，22（2）：166-167.

[8]THOMPSON M P， KURZROCK R. Epstein-Barr virus and cancer[J].  Clinical Cancer Research， 2004，10（3）：803-821.

[9]KIMURA H， KAWADA J I， ITO Y. Epstein-Barr virus-associated lymphoid malignancies：the expanding spectrum of he-matopoietic neoplasms[J].  Nagoya Journal of Medical Science， 2013，75（3/4）：169-179.

[10]LUO Bing， WANG Yun， WANG Xiaofeng， et al. Expression of Epstein-Barr virus genes in EBV-associated gastric carcinomas[J].  World Journal of Gastroenterology， 2005，23（5）：629-633.

[11]许建琼，周聪. 弥漫性大B细胞淋巴瘤22例临床病理及免疫组化特点[J].  川北医学院学报， 2004，19（4）：27-29.

[12]LIU S M， CHOW K C， CHIU C F， et al. Expression of Epstein-Barr virus in patients with Hodgkin’s disease in Taiwan[J].  Cancer， 1998，83（2）：367-371.

[13]GAO Jianming， LUO Xiaomin， TANG Ke， et al. Epstein-Barrvirus integrates frequently into chromosome 4q，2q，1q and 7q of Burkitt’s lymphoma cell line （Raji）[J].  Journal of Virological methods， 2006，136（1/2）：193-199.

[14]LIU M T， CHANG Y T， CHEN S C， et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 represses p53-mediated DNA repair and transcriptional activity[J].  Oncogene， 2005，24（16）：2635-2646.

[15]DAWSON C W， TRAMOUNTANIS G， ELIOPOULOS A G， et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 （LMP1） activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway to promote cell survival and induce actin filament remodeling[J].  Journal of Biological Chemistry， 2003，278（6）：3694-3704.

[16]TANNER J， WEIS J， FEARON D， et al. Epstein-Barr virus gp350/220 binding to the B lymphocyte C3d receptor mediates adsorption， capping， and endocytosis[J].  Cell， 1987，50（2）：203-213.

[17]ABADI R Z， SISTANI N S， MOHTASHAM N， et al. The prevalence of Epstein-Barr virus infection in head and neck non-Hodgkin’s lymphomas in Khorasan， Northeast of Iran[J].  Journal of the Pakistan Medical Association， 2013，63（7）：882-887.

[18]MEDEIROS L J， CARR J. Overview of the role of molecular methods in the diagnosis of malignant lymphomas[J].  Archives of Pathology & Laboratory Medicine， 1999，123（12）：1189-1207.

[19]CHIU S H， WU C C， FANG C Y， et al. Epstein-Barr virus BALF3 mediates genomic instability and progressive malignancy in nasopharyngeal carcinoma[J].  Oncotarget， 2014，5（18）：8583-8601.

[20]GRUHNE B， KAMRANVAR S A， MASUCCI M G. EBV and genomic instability-a new look at the role of the virus in the pathogenesis of Burkitt’s lymphoma[J].  Seminars in Can-cer Biology， 2009，19（6）：394-400.

[21]LACOSTE S， WIECHEC E， SILVA A， et al. Chromosomal rearrangements after ex vivo Epstein-Barr virus （EBV） infection of human B cells[J].  Oncogene， 2010，29（4）：503-515.

[22]苗紅霞，卢伟，杨颉，等. 急性淋巴细胞白血病病人EB病毒检测及其临床意义[J].  青岛大学医学院学报， 2017，53（2）：203-205，209.

[23]GRYWALSKA E， ROLINSKI J， PASIARSKI M， et al. High viral loads of Epstein-Barr virus DNA in peripheral blood of patients with chronic lymphocytic leukemia associated with unfavorable prognosis[J].  PLoS One， 2015，10（10）：e0140178.

（本文编辑 马伟平）