基于肽键热振荡理论和酶工程技术的动物药肽类化合物研究△

李晶峰，边学峰，孙佳明，林喆，张辉

长春中医药大学，吉林 长春 130117

据此，课题组提出了肽键热振荡理论，认为动物类中药中的蛋白质在热炮制过程中，经过肽键的热振荡作用，导致其结构发生不同程度的改变，产生更多的活性肽，生理活性发生相应的变化[1]。肽是人体生命活动必不可少的生命物质和营养元素，被誉为生命之源，现代科学表明，肽能够很好地改善多种慢性疾病[2]，现将本课题组的相关研究报道如下。

1 虫类动物药

虫类药因其走窜通达、破血行血、化痰散结、疏逐搜剔之特性[3-4]，深得广大临床医生的重视。本课题组对虫类动物药蜈蚣、僵蚕、水蛭生品进行了全成分分析，石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水超声提取，得到4个不同极性溶媒提取物(见图1)，根据其功能主治、相关活性筛选最佳活性部位。对水提取物按不同分子量进行分离研究，将虫类动物药材水提取物经过超滤离心技术，得到>10 kDa的蛋白、3～10 kDa多肽、1～3 kDa多肽以及<1 kDa寡肽组分(见图2)，相关活性进行筛选，并比较虫类动物药炮制前后与酶解<1 kDa组分的活性，按分式(1)和(2)计算冻干粉收率、寡肽收率。

冻干粉收率=冻干粉质量/药材质量×100%

(1)

(2)

1.1 蜈蚣

蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣SclopendrasubspinipesmutiansL.Koch的干燥全体。具有熄风镇痉、通络止痛、攻毒散结、活血化瘀疗效[5-6]。用于治疗疮疡肿毒、瘰疬结核等，改善机体高黏状态，现多用于抗肿瘤治疗，影响肿瘤细胞的扩散和新生血管的生成，直接抑制肿瘤增生，促进细胞凋亡[7]。中药炮制学中记载焙蜈蚣多用于急慢惊风、破伤风等症的痉挛抽搐、癫痫，蜈蚣炮制后毒性降低，矫味矫臭。本课题组以活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)为指标筛选蜈蚣活血化瘀活性成分。

通过APTT对比实验结果显示，与0.9%氯化钠溶液比较，不同极性溶媒提取物ATPP均有显著升高(P<0.01)，水提取物活性最佳(见图3A)。进一步筛选水提取物不同组分的活性，与0.9%氯化钠溶液比较，蜈蚣不同组分、焙蜈蚣及其酶解<1 kDa组分APTT均有显著提高(P<0.01)，其中<1 kDa的活性要优于其他组分，且蜈蚣经炮制后<1 kDa组分寡肽含量增加，活性增强(见图3B、C)。<1 kDa组分为蜈蚣的活性最佳部分，且天然寡肽产率低，故本实验将蜈蚣>10 kDa蛋白部分进行酶解，得到酶解寡肽，天然<1 kDa较酶解<1 kDa的组分活性好，但酶解寡肽收率更高，可以考虑作为天然寡肽替代品(见图3C)。

图1 动物药不同极性溶媒提取物的提取流程

图2 动物药酶解及水提取物不同组分的提取流程图

注：A.蜈蚣不同极性溶媒提取物抗凝血酶活性；B.蜈蚣不同组分、焙蜈蚣及其酶解<1 kDa组分抗凝血酶活性；C.蜈蚣不同来源(生品、炮制品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与0.9%氯化钠溶液比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 蜈蚣抗凝血酶活性及<1 kDa组分的收率比较

1.2 僵蚕

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriLinnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体。据《神农本草经》中记载，其具有息风止痉、祛风止痛的功效[8]，临床上常用于肝阳上亢、血虚、阴虚等所致的以肢体痉挛、抽搐、颤动等为特点的证候，该证候与帕金森病的临床表现(静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍)相似。僵蚕的辛散之力较强，有腥臭气味，患者直接服用生品会产生恶心、呕吐等反应，因此僵蚕服用前需要将其麸炒炮制来降低其自身的腥臭味和刺激性。故本课题组基于僵蚕的传统功效，重点针对抗帕金森病作用，依据肽键热振荡理论对麸炒僵蚕的炮制机理进行系统研究。

首先，为了筛选僵蚕治疗帕金森病活性组分，应用6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型[9-10]对其全成分进行了系统研究。提取僵蚕4个不同极性溶媒提取物，与空白对照组比较，模型组细胞存活率显著降低(P<0.01)；与模型组比较，不同质量浓度的水提取物及甲醇提取物均有显著提高(P<0.05或P<0.01)，石油醚提取物在质量浓度为0.05、0.1 mg·mL-1时有显著升高(P<0.05)，水提取物活性最强(见图4A)，进而按不同分子量对水提取物进行分离研究，应用对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用进行筛选；与空白对照组比较，模型组细胞存活率显著性降低(P<0.05)；与模型组比较，僵蚕>10 kDa、<1 kDa及麸炒僵蚕<1 kDa在不同质量浓度细胞存活率均有显著升高(P<0.05或P<0.01)，僵蚕在质量浓度为0.25、0.5 mg·mL-1下细胞存活率有显著提高(P<0.05)，5个组分的活性最佳为<1 kDa组分(见图4B)。采用三氯乙酸沉淀法结合双缩脲比色法测定僵蚕炮制前后蛋白及寡肽含量。

僵蚕麸炒后，腥臭味下降，总蛋白含量下降，由0.192 mg·mL-1下降为0.136 mg·mL-1，总寡肽含量升高，且生品>10 kDa组分对SH-SY5Y细胞具有抑制增殖作用，但麸炒僵蚕>10 kDa组分对SH-SY5Y无明显抑制增殖作用(见图4C)。说明炮制后毒性显著降低，同时活性略有下降，这可能是具有一定毒性的蛋白含量下降和活性寡肽含量升高的综合作用结果。僵蚕酶解寡肽收率为天然寡肽的1.31倍，麸炒僵蚕寡肽收率为天然寡肽的1.67倍(见图4D)。

1.3 水蛭

本品为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全体，是我国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后入药，2015版《中华人民共和国药典》中表明水蛭用滑石粉烫，具有治疗清瘀、中风、高血压等功效[11]。本课题组采用抗凝血活性为指标，针对水蛭生品不同极性溶媒提取物及其不同组分进行活性筛选，与0.9%氯化钠溶液比较，水蛭不同极性溶媒提取物及水提取物不同组分ATPP均显著升高(P<0.01)，水蛭的主要活性部位为水层中的1～3 kDa组分，且砂烫水蛭活性高于水蛭(见图5A、B)。水蛭经过加热炮制过程，组织变得疏松，某些大蛋白肽键断裂导致1～3 kDa中寡肽含量有所增加，活性随之增加，有力证明了肽键热振荡理论。为了考察炮制前后水蛭天然和酶解<1 kDa组分活性和寡肽收率的差异，本课题组以水蛭、砂烫水蛭和酶解水蛭为研究对象，以抗凝血活性为指标进行对比研究，并比较三者的寡肽收率。与0.9%氯化钠溶液比较，水蛭酶解与炮制前后天然小肽段ATPP均显著升高(P<0.01)，砂烫水蛭寡肽收率高于水蛭；水蛭天然小肽段活性略高于酶解肽，而酶解肽收率远高于天然寡肽，是天然寡肽的3.9倍(见图5C、D)。

注：A.僵蚕不同极性溶媒提取物对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用；B.僵蚕不同组分对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用；C.僵蚕炮制前后对SH-SY5Y细胞存活率的影响；D.僵蚕不同来源(生品、炮制品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图4 僵蚕对SH-SY5Y细胞的影响及<1 kDa组分的收率比较

注：A.水蛭生品不同极性溶媒提取物抗凝血酶活性；B.水蛭不同组分及其炮制品抗凝血酶活性；C.水蛭酶解寡肽与天然小肽段抗凝血酶活性；D.水蛭不同来源(生品、炮制品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与0.9%氯化钠溶液比较，*P<0.05，**P<0.01。图5 水蛭抗凝血酶活性及<1 kDa组分的收率比较

2 胶类动物药

胶类药材是以动物的皮、骨、甲、角等为原料，用水煎煮浓缩制成[12]，是我国特有传统中药，大多都具有滋阴润燥、补血、止血等功效，在保健、食品行业受到认可与欢迎[13]。

本课题组应用超滤技术将胶类动物药材阿胶、鹿角胶水提取物分为不同分子量：总提取物、>10 kDa的蛋白、1～10 kDa多肽以及<1 kDa寡肽组分进行分析，根据其功能主治相关活性筛选最佳活性部位，并比较胶类动物药材炮制前后<1 kDa组分的活性，天然与酶解<1 kDa组分的活性与寡肽含量。

2.1 阿胶

阿胶是采用马科动物驴Equusasinus L.的鲜皮或干燥皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩，并加入冰糖、豆油等辅料制成的固体胶类药物[14]，也被称为驴皮胶，具有补血、止血、增强免疫的作用[15-16]。阿胶生品一般呈块状、质地坚硬，虽然有较好的稳定性，但是不便于调配和使用，且由于其滋腻之性，久服会对脾胃的消化功能产生不良影响，而经炮制后，较生品易于消化吸收，大大提高了阿胶的生物利用度，传统炮制法主要有蛤粉炒、蒲黄炒。

为了明确阿胶寡肽免疫增强作用的物质基础，对阿胶总提物进行膜分离，得到不同分子量的组分，基于肽键热振荡理论对炮制前后阿胶寡肽的收率及免疫增强活性进行对比研究，以RAW264.7细胞吞噬中性红指数、RAW264.7细胞释放NO的量及细胞因子IL-6分泌量为免疫增强活性指标筛选活性组分。RAW264.7细胞吞噬中性红指数实验中，与空白对照组比较，阿胶水提取物在0.2 mg·mL-1，>10 kDa在0.1 mg·mL-1，1～10 kDa在0.2 mg·mL-1，生品<1 kDa在0.1、0.2 mg·mL-1，蛤粉炒阿胶天然<1 kDa组分在0.05～0.2 mg·mL-1时有显著升高(P<0.05或P<0.01)(见图6A)；阿胶不同组分NO释放量与空白对照组比较，水提取物在0.2 mg·mL-1、>10 kDa在0.2 mg·mL-1、1～10 kDa在0.05 mg·mL-1、<1 kDa在0.05～0.2 mg·mL-1、阿胶酶解<1 kDa在0.2 mg·mL-1、蛤粉炒阿胶天然<1 kDa在0.05～0.2 mg·mL-1均有显著提升(P<0.05或P<0.01)(见图6B)。测定RAW264.7细胞分泌IL-6实验中，与空白对照组相比，阿胶水提取物在0.2 mg·mL-1，>10 kDa在0.1 mg·mL-1，1～10 kDa在0.1、0.2 mg·mL-1，<1 kDa在0.1、0.2 mg·mL-1，蛤粉炒阿胶<1 kDa在0.05～0.2 mg·mL-1差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(见图6C)，上述3种结果均显示蛤粉炒阿胶<1 kDa活性强于阿胶与酶解<1 kDa组分，蛤粉炒阿胶寡肽收率及活性高于阿胶。为了考察阿胶天然寡肽和酶解寡肽收率的差异，以阿胶天然与酶解<1 kDa组分为研究对象，分析比较了二者的寡肽收率。结果显示酶解<1 kDa组分寡肽收率是天然寡肽的4.9倍(见图6D)，虽然酶解<1 kDa组分寡肽活性略低于天然肽，但收率远远高于天然寡肽。

注：A.阿胶不同组分及其炮制品对RAW264.7细胞吞噬指数的影响；B.阿胶不同组分及其炮制品对RAW264.7细胞释放NO量的影响；C.阿胶不同组分及其炮制品对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响；D.阿胶不同来源(生品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图6 阿胶对RAW264.7细胞的影响及<1 kDa组分的收率比较

2.2 鹿角胶

鹿角胶为马鹿CervuselaphusLinnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck的角经煎煮、浓缩制成的固体胶，具有补肾壮阳、增强免疫力等功效。传统的鹿角胶块存在不易烊化、口感不佳、服用不便等问题，蛤粉与鹿角胶共制可除去药物的腥味，降低其滞腻之性，增强疗效[17]。鹿角胶的应用领域不断拓展，在保健和许多疾病治疗中发挥着重要的作用。

对鹿角胶水提取物不同组分免疫增强活性及炮制前后寡肽的收率进行对比研究。以RAW264.7细胞吞噬中性红指数为免疫增强的指标，筛选鹿角胶炮制前后<1 kDa寡肽为活性组分，与空白对照组比较，鹿角胶>10 kDa在0.2 mg·mL-1，鹿角胶1～10 kDa在0.1、0.2 mg·mL-1，鹿角胶与鹿角胶珠在0.05～0.2 mg·mL-1差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(见图7A)，炮制后，鹿角胶珠<1 kDa组分的寡肽收率高于鹿角胶(见图7B)。

注：A.鹿角胶不同组分及其炮制品对RAW264.7细胞吞噬指数的影响；B.炮制前后<1 kDa组分的收率比较；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图7 鹿角胶对RAW264.7细胞的影响及<1 kDa组分的收率比较

3 角类动物药

角类药材是动物药的重要组成部分之一，多为名贵中药，如《神农本草经》中就记载了犀角、羚羊角、鹿茸等[18]。角类由角质细胞组成，具有活性强、疗效好、不良反应小、潜力大、应用广的特点。

本课题组将角类动物药材鹿茸、山羊角水提取物按不同分子量(>10 kDa的蛋白、1～10 kDa多肽以及<1 kDa寡肽组分)进行分析，根据其功能主治相关活性筛选最佳活性部位。并比较其炮制前后及其酶解、天然<1 kDa组分的活性与寡肽收率。

3.1 鹿茸

鹿茸为马鹿CervuselaphusLinnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，是我国常用中药材，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等功效[19]。本实验对鹿茸鲜品应用超滤离心技术分为>10 kDa、1～10 kDa、<1 kDa组分。以睾丸间质细胞睾酮分泌量为体外壮肾阳活性指标，筛选鹿茸炮制前后的壮肾阳活性部位，与空白对照组相比，鹿茸1～10 kDa在0.2 mg·mL-1、鹿茸<1 kDa在0.05～0.2 mg·mL-1、烘烤鹿茸<1 kDa在0.05～0.2 mg·mL-1、热炸茸<1 kDa在0.05 mg·mL-1、热炸茸酶解<1 kDa在0.05 mg·mL-1、鹿茸酶解<1 kDa在0.05～0.2 mg·mL-1时睾酮分泌量有显著增加(P<0.05或P<0.01)，其中烘烤茸<1 kDa组分活性最强(见图8A)，因此确定鹿茸<1 kDa为壮肾阳活性部位。为了考察鹿茸天然寡肽和酶解寡肽的收率差异，本课题组以鲜茸、热炸茸和烘烤茸为研究对象分析了鹿茸炮制前后的天然和酶解<1 kDa寡肽含量。结果显示，鹿茸天然<1 kDa组分活性及寡肽含量均略高于酶解<1 kDa组分，其中烘烤茸<1 kDa组分壮肾阳活性最强，寡肽含量最高，为89.24%。而酶解寡肽收率远高于天然寡肽，是天然寡肽的3.8倍(见图8B)。

注：A.鹿茸不同组分及其炮制品对睾丸间质细胞分泌睾酮量的影响；B.鹿茸不同来源(生品、炮制品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图8 鹿茸对睾丸间质细胞的影响及<1 kDa组分的收率比较

3.2 山羊角

山羊角为牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角。《吉林中草药》指其能“镇静，退热，明目，止血”[20]，《医林纂要》记载“功用近羚羊角”。山羊角药材加工炮制应用具有历史考证，《中药大辞典》山羊角项下记载：“磨粉或烧焦研末”。为阐明山羊角经炮制后化学成分及药理活性的变化，本课题组从山羊角活性成分筛选入手，以治疗痛经与免疫调节为目标活性，考察山羊角的活性成分，采用超滤膜分离技术将山羊角水提取液分离为不同组分，通过考察对多种子宫收缩促进剂所致离体子宫平滑肌收缩的影响考察其活性，对山羊角不同组分及150 ℃烘烤品和200 ℃烘烤品<1 kDa组分进行了比较分析，与空白对照组相比，山羊角1～10 kDa可显著抑制由缩宫素引起的收缩(P<0.05)，山羊角<1 kDa、150 ℃烘烤品、200 ℃烘烤品可显著抑制由缩宫素与KCl引起的收缩(P<0.05或P<0.01)，结果表明<1 kDa组分为山羊角治疗痛经活性成分，且呈现200 ℃烘烤品>150 ℃烘烤品>山羊角生品的趋势(见图9A)，山羊角炮制前后<1 kDa组分中寡肽收率趋势同上(见图9B)。

注：A.山羊角不同组分及其炮制品对缩宫素与KCl引起大鼠子宫平滑肌条收缩的影响；B.山羊角不同来源(生品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图9 山羊角对大鼠子宫平滑肌条收缩的影响及<1 kDa组分的收率比较

4 贝壳类动物药

贝壳类药材是临床常用中药，具有宁心安神、平肝潜阳、清肝明目、软坚散结等功效[21]，是一类同时具有动物药和矿物药特性的特殊类药材[22]，虽然贝壳类药材临床应用广泛，但其研究相对较少。课题组以临床常用贝壳类药材牡蛎、石决明为代表，比较煅制前后的相关活性。

4.1 牡蛎

牡蛎是长牡蛎OstreagigasThnunberd、大连湾牡蛎OstreatalienwhanensisCrosse或晋江牡蛎OstrearivularsGould的贝壳，具有壮阳作用[23]。与空白对照组相比，牡蛎蛋白在0.2 mg·mL-1、牡蛎烘烤品蛋白在0.05～0.2 mg·mL-1时能够显著提高睾丸间质细胞分泌的睾酮能力(P<0.05或P<0.01)，牡蛎烘烤品蛋白对睾丸间质细胞分泌睾酮的作用强于牡蛎蛋白(见图10)。

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图10 牡蛎与其炮制品对睾丸间质细胞分泌睾酮量的影响

4.2 石决明

石决明Sea-earShell为鲍科动物，多为杂色鲍、皱纹盘鲍、耳鲍、羊鲍等的贝壳，具有抗高血压、增强抗氧化的功能。本课题组体外测定石决明对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用，在37 ℃条件下，ACE能催化分解血管紧张素Ⅰ的模拟物马尿酰组氨酸亮氨酸(HHL)产生马尿酸[24]，而当加入不同质量浓度的石决明提取液时，ACE抑制活性受到不同程度的抑制，马尿酸的生成量减少。与空白对照组比较，石决明水提取物、1～10 kDa、<1 kDa、煅制品<1 kDa组分对ACE均有显著抑制(P<0.05或P<0.01)，石决明对ACE抑制率的强弱顺序为：石决明煅制品<1 kDa、石决明<1 kDa、石决明总提取物、石决明1～10 kDa(见图11A)。酶解寡肽收率高于天然1 kDa组分(见图11B)。

注：A.石决明不同组分及其炮制品对ACE抑制作用的影响；B.石决明不同来源(生品、酶解)<1 kDa组分的收率比较；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图11 石决明对ACE抑制作用的影响及<1 kDa组分的收率比较

5 讨论

我国药用动物资源极其丰富，药用动物资源是生产动物药的物质基础，是中药资源的重要组成部分。动物药是传统中药的重要组成部分，历史悠久，临床疗效明显。动物药含有丰富的蛋白质成分，蛋白质不是仅以氨基酸形式吸收，而更多以肽的形式吸收，且肽具有更好的活性。牡蛎肽及扇贝裙边肽具有较好的降血压效果[25-26]；三文鱼胸鳍肽、鹿茸肽可通过抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮的产生来表现出抗炎活性[27-28]；羊骨髓肽及其螯合物可促进体外培养成骨细胞的增殖并增强其成骨活性[29]。

中药炮制后可以改变药物的成分和功能，提高药效，降低毒性和副作用[30-32]，如盐杜仲可破坏生杜仲中的胶质，增强临床疗效；如草乌、川乌炮制能够解其毒性；在炮制过程中可加入辅料，如蛤粉炒阿胶、砂烫水蛭、麸炒僵蚕。

本文以虫类、胶类、角类、贝壳类4类动物药为代表，以功能主治相关活性对其进行全成分分析，结果显示水提取物活性最佳，水提取物中<1 kDa组分效果最优；为了明确动物药传统热炮制加工机理，本文基于肽键热振荡理论对炮制前后寡肽含量及活性进行对比研究。经过加热炮制过程，组织变得疏松，易于有效成分溶出，小肽段<1 kDa或1～3 kDa组分中寡肽含量增加，且活性增强，这是由于高温后在肽键热振荡的作用下肽键产生裂解生成了更多小分子量的寡肽。天然寡肽较酶解寡肽活性好；但酶解寡肽收率较高，可作为天然寡肽的补充品。本研究为其开发和利用提供科学依据，解决了天然寡肽收率较低、难于产业化的问题。今后应加大对动物药材小肽类物质开发力度，以创新产品为龙头，不断丰富祖国医学和天然、绿色、保健产物的宝库。