利用SSR分子标记构建名山茶树基因身份证

刘冠群，吴祠平，谭礼强，谭 杰，杨婉君，唐 茜*

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.贵州省茶叶研究所，贵阳 550006；3.四川省雅安市名山农业局，四川雅安 625100）

茶树为多年生常绿木本植物，不论野生型或栽培型茶树都属于山茶属（Camellia）茶组（Sect.Thea）各个种。中国是茶树的原产地和茶的故乡，起源于我国云南[1-2]，是重要的经济作物，广泛种植于我国四川、云南、贵州等20 多个省市和地区。名山茶树良种繁育场是四川最大的茶树良种繁育场，截至2016年，有各类不同品种或品系达1 200 余份，且随着茶树的育种方式的不断创新，越来越多的种质资源得以收集和保存，为了保护我国这些特有和优异茶树种质资源，促进资源的有效区分和合理利用，保障我国茶叶产业发展，还需积极开展茶树种质资源的特异性鉴定和种质识别技术研究。

SSR（simple sequence repeat），也称微卫星（microsatellite）。广泛应用于植物基因定位和QTLs 分析、DNA 指纹和品种鉴定、种质资源保存和利用、系谱分析以及标记辅助育种[3]。通常呈共显性遗传，其多态位点丰富，实验操作简单易行。近年来SSR 分子标记技术在植物不同品种身份鉴定取得了可喜的进展。邱杨等[4]利用22 对SSR 引物对75 份萝卜材料鉴定，结果选用8 对引物将完全区分开并建立了分子身份证。黄丹娟[5]利用30 对SSR 引物研究了39 个茶树品种，选用其中4 对可将所有品种区分开且构建了分子二维码。高源等[6]从32 对合成引物中筛选出16 对稳定性高和重复性好的引物用于131份苹果属植物指纹图谱构建。张靖国等[7]用17 对多态性引物对20 个梨栽培品种进行扩增，建立了20个梨栽培品种的分子身份证。SSR 标记法在植物品种身份鉴定上被广泛应用和接受，而在茶树方面目前还未出台该类似标准。本研究借鉴前人所使用的微卫星标记技术，首次尝试对名山24 份具有代表性的茶树种质进行分子身份证二维码研究，结合被机器快速扫描的二维码分子身份证，旨在为名山茶树种质资源有效保护、材料的快速鉴别提供有效的探索，以期正确反映或标识四川省茶树种质的多样性和特异性，促进特异和优异茶树资源的有效鉴别与保护利用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

本试验选取24 份材料含有国家级良种、省级良种、地方品种见表1，是四川农业大学园艺学院的研究人员于2016年9 月份在名山茶树良种繁育场资源圃内采集，每份茶树种质取10 株，选取嫩芽混合取样，用锡箔纸包裹每份种质材料，用记号笔编号立刻放入-196 ℃的液氮罐内保存，带回实验室并转入-80 ℃超低温冰箱。SSR 引物是根据已经公布序列的引物挑选出（见表2）。

表1 供试茶树材料名称和原产地信息Table 1 Name and origin of evaluated samples

表2 筛选出的适合本研究7 对茶树SSRTable 2 Selected 7 SSR primers used for the tea analyse

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 的提取

使用天根生化科技（北京）有限公司生产的DP305 植物基因组试剂盒主要参照天根试剂盒使用说明书方法提取茶树新梢基因组DNA，先将提取出的DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，拖尾降解的DNA 将重新提取，完整性较好的DNA，使用核酸测定仪检测DNA 浓度，后将每份样品 DNA 稀释到 25～30 ng/L 的浓度，并储存在-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 PCR 扩增反应与聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR 反应总体积为 15 μL，取 DNA 模板 2 μL，30 ng/μL，10 mmol/L 浓度的上下游引物各 0.3 μL，2.5 mmol/L 的 dNTPs 加 0.3 μL，10×PCR Buffer 加1.5 μL，1U Taq 酶，25 mmol/L MgCl2加 1 μL，后加超纯去离子水补充值15 μL。PCR 扩增程序[11]为：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30 个循环后，72 延伸 7 min，最后4 ℃保存。试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。扩增在Bio-Metra 96 上进行。点样前加入3 μL 含量为1%的溴酚蓝混匀，在含8% 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳检测，电压160 V，时间80 min，电泳仪为六一仪器厂的DYY-6C 型号，电泳槽为HTSCZ04 型号垂直电泳槽，电泳完后用银染法洗条带显色，在观片灯下用高清单反照相机拍照相并保存原始图片（如图1）。

图1 筛选出的引物TM169 对24 份茶树材料扩增结果Figure 1 Amplified results of 24 tea cultivars with primer TM169

1.2.3 数据的处理和二维码的转换

将电泳图谱上清晰可见带型，根据扩增的目的基因从大到小依次编排第一位点、第二位点、第三位点等，再根据位点分为 A/A、B/B、C/C、A/B、A/C、B/C 等不同的基因型，如表3 所示，将A/A 基因型记为 1、B/B 基因型记为 2，C/C 基因型记为 3、A/B 基因型记为 4、A/C 基因型记为5、B/C 基因型记为 6、A/B/C 记为7、无条带的泳道读为?/?并记为8、其他类型记为9。最后按照引物固定排列顺序，串联形成一组引物对应的转换数据（见表3），也就是该品种的分子身份证。将每份茶树种质所得的分子身份证号与茶树名称及其他信息相结合的方法，通过在线二维码转换器（https：//cli.im/）将表4 的原始数据转换为分子数据二维码（见图3），所得二维码就是早逢春等24 份不同茶树品种的身份信息。

2 结果与分析

2.1 24份茶树种质SSR标记多态性分析

经过挑选8 份形态学差异较大的茶树DNA 做模板，从51 对合成引物中筛选出7 对扩增多态性高、带型清晰、重复试验均出现同样带型的引物，分别是 A18、A114、TM056、TM169、TM237、CsFM1058、CsFM1059。7 对引物在24 份种质中共扩增出154条谱带，每对引物扩增出的等位基因数为3～5 个，平均 4 个；多态信息含量（PIC）最小为0.4，最大为0.7，平均多态信息含量为0.56，其中引物CSFM1058多态信息含量最低为0.4；引物A18 在这24 份材料扩增的多态信息含量最高为0.7。

表3 不同基因型的编号Table 3 The code of different genotypes

表4 原始数据矩阵Table 4 The original data matrix

图2 是基于Nei's 遗传距离构建的UPGMA 聚类图，各品种基本按照遗传背景聚类。根据上图可知，紫嫣与其他品种在相似度为0.3 左右单独分开，说明紫嫣是非常特殊品种与其他23 份茶树存在着较大不同，中茶 108 与川沐29 等品种在相似度为0.89 聚在了一起，两者的亲缘关系比较相近。由来自云南省的两个省的品种云梅和木兰1 聚在了一起，福建省育成的黑旦与肉桂、黄玫瑰等，以及由中国农业科学院茶叶研究所育成的中茶108 和郁金香等，分别聚为不同的小类群；我国台湾岛的金萱与其他品种相似度相对较远。

2.2 分子二维码对茶树种质资源的保护

指纹图谱代码构建方法参考邱阳和黄丹娟等[4-5]图谱代码构建方法，简化如下。对PCR 电泳图进行人工读带，同一引物扩增出来的DNA 片段从大到小依次记录，根据不同的位点的等位基因，分别标为 A/A、B/B、C/C、A/B、A/C、B/C 等基因型。按照引物排 列 顺 序 依 次 为 TM056、TM169、TM209、TM237、CSFM1599、CSFM1058、A18，建立起原始数据矩阵。（见表4）根据特征谱带统计数据结果将其转换为阿拉伯数字串符，将字串符数据进行比对，要求任何两个品种数字不重叠，即每份茶树分子身份证号（见表5）。例如；歌乐茶的分子身份证号为4544515。再利用二维码生成器将每份分子身份证号转换成二维码，即得到每份种质的分子二维码（见图3）。该分子二维码能够被任何扫码机器快速、准确识破，并能够快速显示茶树的身份信息，这对不同茶树品种的鉴定与保护能够提供可靠的依据。

图2 参试材料UPGMA 聚类分析树状图Figure 2 Dendrogram of tested materials using UPGMA clusteranalysis

表 5 7 对SSR 引物在24 个茶树品种中多态性扩增结果Table 5 Amplification information of 7 primer pairs in 24 tea cultivar

3 讨论与结论

DNA 分子指纹检测技术能够实现植物新品种的快速鉴别[12]。我国目前仅有苹果和玉米等颁布了DNA 指纹检测技术标准。茶树品种鉴定DNA 指纹方法从表2 数据来看，单一的引物不足以区分这24个茶树品种，TM056、TM169、TM209、TM237、CSFM 1599、CSFM1058、A18 这 7 个引物单独鉴定品种能力各不相同，其中A18 在24 材料扩能增出5 种不同等位基因型。基因型过多会为条带统计降效果而增加负担，利用不同引物组合则可以区分更多的茶树品种。本研究将这7 对引物组合，根据刘峰等[13]提出核心引物理论上可鉴别区分的最大品种数的计算公式为N=G1×…×Gn，假如每对引物平均鉴定出4个不同等位基因，那么这7 个引物理论上可鉴定的最大品种数为47=16 384 个，理论上这7 对引物可以满足现有茶树PVP 申请品种鉴定的需要，本研究根据不同基因型构建的分子身份证号能够完全区分这24 份材料，但是，还有可能出现与这些材料相同基因型的材料，不足以区分所有的种质材料，因此，应根据茶树连锁遗传图谱相同连锁群位置选择备用引物，当两个品种分子身份证号完全相同时，可添加备用引物对其再次区分，以验证其存在明显基因型差异。

图3 24 份茶树品种的分子二维码Figure 3 The molecular qr codes of 24 tea cultivars

目前，我国茶树新品种的鉴定与保护主要通过DUS 测试，但是由于茶树的表型性状易受外界条件的干扰，常常不能真实地反映基因型，预见性差。利用微卫星标记技术在植物的不同发育阶段、不同组织都可以进行检测，使得对基因型的早期选择成为可能；不受环境影响；表现为共显性遗传，有利于对隐性基因的选择；标记数量大等优点[14-15]。本研究构建了24 份中国茶树代表品种的分子身份证，并将其生成分子二维码，这种二维码分子身份证可以被任何扫码机器解读，快速地识别不同茶树种质身份信息，彻底摆脱人工读取字串符的麻烦。

近年来，随着四川省名山茶树良种场收集各类优质资源力度加大，保存的不同种质数量迅速增加。如何能够快速准确地判定同名异物或同物异名的茶树材料，通过建立茶树分子数据库或分子身份信息识别平台，对茶树种质资源的鉴定与保护具有广阔的应用前景。利用微卫星标记构建的分子身份证能够正确反映或标识茶树种质的真实性和特异性、有效地防止名山繁育场特有资源的流失提供依据和技术支持。

本研究依据引物扩增的多态性信息含量和对茶树种质的区分率，从51 对SSR 引物中筛选出7对扩增条带清新的核心引物组合，区分24 份地方品种、省级良种及国家级良种种质资源茶树，并基于指纹图谱的基因型构建得身份证号，能被机器快速准确识别的分子二维码，为快速鉴定名山茶树良种繁育场茶树种质资源和优良品种保护提供了理论依据。