HPV16基因组甲基化对宫颈病变的影响

吴 思，孙峥嵘

(中国医科大学附属盛京医院生物样本库，沈阳 110004)

宫颈癌位居全球女性癌症相关死亡诱因的第四位，也是发展中国家第二大常见癌症[1-2]。临床及流行病学相关研究表明，宫颈癌的发生发展与持续感染高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)有关，以HPV16亚型最常见，约50%的宫颈癌前病变与HPV16相关[3]。目前，尚无有效的宫颈癌治疗手段，因此，对宫颈癌的发生发展机制的进一步研究十分重要。持续感染高危型HPV16会导致一系列癌前病变，最终导致宫颈癌发生。HPV16通过调控宿主细胞基因组的遗传和表观遗传影响宿主细胞的正常生理状况，进而诱发癌变[4]。部分女性接触高危型HPV16后，仅成为HPV携带者，表现为一过性感染，而不发展为宫颈癌。因此，不能将HPV16全基因组DNA检测作为临床诊断宫颈癌的检测指标，需要继续寻找特异性更高的检测指标[5]。

DNA甲基化是修饰DNA的一种方式，不改变基因组DNA，仅改变表观遗传表现，是细胞维持基因稳定和调节基因表达的主要因素[6]。宫颈癌等疾病患者的癌细胞DNA甲基化发生异常改变，表明DNA甲基化可能与癌症的发生密切相关[7-9]。现对HPV16 DNA甲基化对宫颈癌发生发展的影响予以综述，探讨其潜在分子机制及遗传学改变，旨对宫颈癌预防及治疗提供新的思路。

1 HPV16 DNA甲基化与宫颈上皮内瘤变

HPV、乙型肝炎病毒等肿瘤相关DNA病毒的DNA甲基化与病毒基因表达、免疫应答以及致肿瘤性等病毒生物学行为相关[10-11]。与真核细胞DNA甲基化作用类似，病毒DNA甲基化可调控病毒复制及转录，进而影响病毒的遗传表现。DNA甲基化指在DNA甲基转移酶的作用下，胞嘧啶环的第5位加入一个甲基基团，从而形成5-甲基胞嘧啶的过程。5-甲基胞嘧啶主要位于紧邻鸟嘌呤上游的DNA序列中，可形成甲基化CpG二核苷酸。当宫颈组织细胞发生瘤变时，细胞基因组甲基化模式紊乱，表现出全部或特定基因组甲基化的改变，其中，CpG位点的DNA甲基化主要影响基因的表达。研究表明，DNA甲基化与细胞异常增生有关，可导致肿瘤的发生发展，且CpG的甲基化水平可作为定量分类器准确区分重度宫颈上皮内瘤变和宫颈原位癌[12]。HPV基因组中没有经典的CpG位点，但存在高密度CpG区域，且特定的高甲基化E1 CpG可能增加了HPV16阳性重度宫颈上皮内瘤变进展为宫颈原位癌的可能性，可见HPV不同区域CpG位点的甲基化具有重要的生物学意义[13]。 HPV可利用宿主细胞器进行转录和复制，其生命周期与宿主细胞的分化密切相关。在W12E细胞系中进行的HPV16基因组的CpG甲基化分析表现出一种新的甲基化模式，即E2反应性转录模板中的CpG二核苷酸的全部胞嘧啶甲基化或E2蛋白结合位点中的CpG二核苷酸的特异性胞嘧啶甲基化，且此模式的甲基化可以抑制HPV16 E2蛋白的转录激活[14]。研究认为，病毒可能利用宿主细胞某种保护性机制使病毒逃避宿主免疫的识别，并维持感染，此机制包括宿主将正链病毒DNA作为异源DNA，并通过靶向病毒DNA的外部修饰抑制基因转录，或病毒可能通过恢复人甲基转移酶的外部修饰和(或)组蛋白去乙酰酶对染色质的重塑而策略性地调控病毒自身基因表达[4]。病毒整合废除了抑制致癌基因E6和E7表达的E2基因，导致感染上皮细胞的广泛增殖和恶性转化。宫颈癌E6和E7区域中免疫刺激性CpG基序内的病毒DNA甲基化的过度表达提示，HPV16在此类CpG基序的宫颈癌发病机制中起免疫逃避作用[15]。采用焦磷酸测序法测量HPV DNA甲基化的研究表明，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45的L1/L2区域基因的高甲基化与宫颈癌发生相关[16]。HPV基因组中，高水平CpG甲基化与宫颈癌前病变相关，尤其是HPV衣壳L1和L2基因中的甲基化水平[17]。Chaiwongkot等[18]的研究证明，HPV可诱导转化感染过程中的L1基因的甲基化，并可作为预测宫颈癌快速进展的潜在生物标志物。

流行病学和临床研究中的HPV甲基化主要集中在HPV16型。HPV16基因结构是双链环状DNA，长度约为8 000 bp，分子量为5×106，包含长调控区(long control region，LCR)、早期区(E1、E2、E4、E5、E6、E7区)和晚期区(L1、L2区)。LCR是病毒的主要调控区，有多个调控元件(如启动子、增强子及多种细胞转录因子)的结合位点，可对病毒基因的复制、转录进行调节，见图1。既往研究显示，HPV16型LCR的甲基化程度与宫颈上皮内瘤变2/3的发生风险增加相关，但目前相关研究结果仍不一致[19-25]。有研究证明，感染HPV16受试者基因的甲基化程度可随宫颈组织病理分级的升高而增加，并经常观察到浸润性宫颈癌患者宫颈病变组织的高甲基化，表明基因高甲基化可能降低蛋白质的表达，并参与宫颈癌的发生[20]。另有研究发现，宫颈癌患者存在最高比例的LCR CpG甲基化，无症状感染HPV者的甲基化水平次之，宫颈上皮内瘤变患者LCR的甲基化比例最低[21]。Mirabello等[22]通过评估HPV16 L1基因的焦磷酸测序和特定CpG的甲基化水平发现，甲基化水平升高可增加HPV16阳性人群发生宫颈癌的风险。但也有研究认为，随着宫颈病变的进展，LCR CpG甲基化的比例呈下降趋势；或LCR或LCR中E2结合位点的CpG甲基化程度与宫颈病变严重程度呈负相关[23]。上述研究观察结果不一致的原因尚未完全明确，可能与甲基化检测技术(通常不足以检测低丰度的DNA甲基化)的差异和/或样本量较小有关。

LCR：长调控区；5′LCR：长调控区基因5′端；Central：中央区；3′LCR：长调控区基因3′端；Enhancer：增强子；Promoter：启动子；Repl Orig：复制起始点

图1 HPV16基因组LCR区15个CpG位点图

2 HPV16 DNA甲基化与病毒转录的相关性

甲基化相关的HPV16转录沉默的数据主要来源于体外研究。研究显示，HPV16 LCR的CpG二核苷酸在SiHa细胞中处于非甲基化状态，但在被转录激活的仅有一个或极少数拷贝HPV16基因组的CaSki细胞中的甲基化程度很高[26]。与SiHa细胞(1～2拷贝/细胞)相比，CaSki细胞中存在超量的HPV16基因组(>500 拷贝/细胞)，两种细胞系的E6/E7转录本数量类似。E6/E7致癌基因的转录主要受不同细胞转录因子与位于HPV16基因组LCR转录调控元件的结合和相互作用的调节[27]。有研究显示，位于增强子fp5e结合位点或启动子HpaⅡ结合位点的CpG二核苷酸的甲基化作用能够阻止功能性转录复合物的形成[28-29]。研究发现，某些核蛋白可与转录激活因子竞争位于LCR fp5e和Hpa Ⅱ以外的甲基化CpGs位点，并通过HDAC实现甲基化相关修复作用诱导更紧密的染色体构型，从而实现转录抑制[29-30]。此外，HPV16中的E2蛋白可与其LCR同源结合位点构成调节环，并根据调节环的不同位点激活或抑制早期基因的转录[31]。体外研究发现，增强子内以E2为主以及异源输入的E6/E7病毒蛋白能够诱导显著的再甲基化，并在一定程度上导致启动子区域自身的甲基化或与染色体闭合相关的转录抑制[29]。

通过LCR中CpG的甲基化模式可更好地反映基因沉默情况。但关于HPV16自然感染CpG甲基化对病毒基因转录影响的报道较少。Park等[32]对9例口腔鳞状细胞癌患者的RNA标本进行研究证实，HPV16基因组中LCR的超甲基化与可检测到的E6/E7表达水平相关。此外，其他小样本研究也得到了类似的结论[33-34]。Vinokurova和von Knebel Doeberitz[35]对HPV16感染宫颈组织样本的微分裂细胞甲基化的分析证明，来自损伤或转化细胞的HPV16基因组任何位置的甲基化均与鳞状上皮分化的各阶段相关。由此可见，广泛病毒基因的甲基化可以阻止病毒基因的表达，使细胞中的病毒基因组处于非激活状态，且不引发任何病理效应。基于已有证据的内在联系推测，HPV16基因组甲基化可能是早期病毒致瘤基因参与宫颈上皮内瘤变发展的敏感指标。明确CpG甲基化与自然感染状态下HPV16转录的关系，将有助于更好地了解HPV相关宫颈病变的发生机制。

3 HPV16 DNA甲基化与病毒载量的相关性

HPV载量反映了病毒的活跃程度，病毒载量和DNA甲基化均为HPV感染后宫颈鳞状细胞癌发生过程的特异性分子事件。目前研究的含HPV16的宫颈癌细胞系有SiHa细胞和CaSki细胞，前者细胞中仅含有2个具有转录活性的病毒基因拷贝，而后者细胞中含有较多的病毒基因拷贝，但仅有1个整合于14号染色体的拷贝具有转录活性。细胞学实验证实，HPV16基因拷贝数与甲基化水平相关，HPV16基因拷贝的CaSki细胞中启动子和增强子的CpG位点甲基化水平明显高于SiHa细胞，且CaSki细胞中多余的沉默拷贝可在5-氮杂胞嘧啶核苷的作用下重新获得转录活性[36-38]。除影响细胞启动子和增强子甲基化外，还可通过调节E2、E6/E7的甲基化水平调控病毒的复制和转录，使细胞表现出稳定的基因型，可见HPV16的表达可能取决于病毒启动子、增强子和E2基因的甲基化状态[34]。既往研究也证明，由HPV16感染引起的宫颈病变中的E2区域也会发生不同程度的甲基化，其中癌细胞E2区域甲基化的程度最高，但其在宫颈癌前病变细胞与正常宫颈细胞的甲基化水平的差异不大，故E2基因甲基化水平可用来区分正常细胞、癌前病变细胞与宫颈癌细胞[21]。在组织学实验中，Mirabello等[22]采用实时定量聚合酶链反应检测237例 HPV感染者的HPV16载量，并采用焦磷酸测序法定量检测HPV16 L1区和LCR 66个位点的甲基化水平，未发现病毒载量与甲基化之间的相关性。已知HeLa细胞和C4-Ⅰ细胞是HPV18型宫颈癌的主要细胞系，其中HeLa细胞为宫颈腺癌细胞系，含有较多的HPV18基因拷贝，其含量约为50个，而C4-Ⅰ细胞中整合的HPV18基因拷贝含量极少[39]。与HPV16感染不同，感染HPV18的HeLa和C4-Ⅰ细胞中的HPV18 DNA启动子和增强子区域均为低甲基化，但在HeLa细胞HPV18 L1区的甲基化水平显著高于C4-Ⅰ细胞。通过对宫颈脱落细胞HPV-18 L1基因进行甲基化特异性聚合酶链反应定量检测的实验研究发现，宫颈癌患者HPV-18 L1基因始终处于高甲基化状态，但无症状患者的HPV-18 L1基因常为低甲基化或未甲基化状态。在宫颈癌前病变中，L1偶发高甲基化，且疾病严重程度与L1高甲基化程度相关[39]。此结果在组织学实验中也得到了证实，对HPV18感染的宫颈癌组织标本和无症状感染者的宫颈组织标本进行L1/L2片段甲基化水平检测发现，80%的癌组织标本的L1区存在甲基化，且明显高于无症状感染组；病毒整合后，L1区甲基化可促使其余HPV18基因拷贝丧失活性[40-41]。综上所述，L1基因甲基化可作为筛查HPV18感染所致宫颈病变的指标。HPV16和HPV18是宫颈癌的常见病毒感染类型，两者LCR的转录元件和转录因子相同。大量研究发现，HPV16和HPV18的DNA甲基化模式不同，其甲基化模式可调节病毒表达，并在病毒整合过程中发挥重要作用[13,22,39]。HPV的DNA甲基化及病毒载量可能存在一定关联，但其生物学意义的关联尚不清楚。

4 结 语

目前，尚无准确快捷的HPV感染检测方法。HPV DNA检测的敏感性很高，但诊断宫颈癌的特异性较巴氏涂片检测低。与液基薄层细胞学检测技术相比，HPV检测的假阳性率较高。高危HPV DNA重复筛选获得了较高的宫颈癌诊断敏感性和特异性，但随访费用较高，不易广泛使用。近年来，已明确了HPV DNA甲基化修饰在宫颈癌发生中的重要作用。HPV DNA甲基化检测可能成为具有潜在应用价值的区分感染结局的生物标志物，有助于探索病毒基因组和生命周期以及与宿主的相互作用，更全面地了解HPV感染导致的疾病过程、更准确地检测临床癌前病变、更个性化地识别和管理具有真正进行性致癌潜力的病变。HPV DNA甲基化检测不仅可以丰富其他生物标志物的早期诊断和预后评估标志，提高临床检测的敏感性和特异性，还可改善宫颈癌放疗和化疗的敏感性，为新药开发提供帮助。