禽流感高敏荧光免疫分析快检试剂盒的研制与应用

王泽洲，吴俊清，章健，吴冠英，陈弟诗，贺冬梅

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

由于H7N9亚型禽流感对人具有传染性和致死率，可能对公共卫生安全和社会稳定造成较大的危害和影响，因此对该病的早期诊断、监测非常重要。本研究应用镧系元素作荧光标记物，研制了一种既简单方便、快捷，又准确、特异、敏感的禽流感高敏荧光免疫分析快速检测试剂盒（LFICA）。现将初步研究结果报告如下:

1 材料和方法

1.1 材料禽流感（AI）通用型单抗，禽流感H7亚型单抗，羊抗兔IgG抗体、兔IgG抗体，H9、H7、H5、H3亚型禽流感抗原，新城疫（ND）抗原和鸡传染性支气管炎（IB）抗原等，鸡泄殖腔和咽喉拭子样品由相关合作单位提供。吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺，切条机、点膜与喷金膜机，镧系荧光纳米微球和荧光仪，其他试剂均为国产分析纯。制备包被膜、抗体标记微球、双抗体夹心法建立等，均参照说明书或按照相关要求操作。

1.2 荧光免疫分析试纸条的组装在湿度小于30%，温度20～25℃的环境下，把吸水纸、标记物垫和样品垫按顺序粘贴在聚氯乙烯底板上形成微反应体系，然后将其切割成0.5 cm宽，即成试纸条（图1），将试纸条装入卡壳中制成检测卡，装入铝箔袋封存备用。

图1 镧系荧光免疫层析法结构示意图

1.3 标准曲线以标准阳性抗原和阴性样本建立标准曲线。相关阳性抗原和阴性样本由本单位提供。

1.4 特异性试验选取H9、H7、H5、H3亚型禽流感抗原、新城疫抗原等阳性样品，稀释40倍，应用禽流感高敏荧光免疫分析试纸条检测，同时设空白和阴性对照，以确定该方法是否发生交叉反应。

1.5 敏感性试验将H9、H7、H5、H3标准阳性抗原进行1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1:10 240倍比稀释，每个稀释度平行做4个重复，分别用建立的通用型和H7亚型AI-LFICA试剂盒检测，判断抗原检出滴度。

1.6 重复性试验在相同条件下，选取8份AIV抗原含量不同的样本，每份样本平行做10个重复，分别用组装的通用型和H7亚型AI-LFICA试剂盒检测（批号为20180613），同时对检测结果进行统计学分析。

1.7 比较试验用同一份样本同时进行HA、Bionote试纸条、荧光RT-PCR和AI-LFICA检测，并对结果作比较，计算AI-LFICA相对于其他试剂盒的符合率、敏感性和特异性。

1.8 试剂盒的组装及保存期试验AI-LFICA试剂盒由荧光检测仪、检测卡、连接线组成。试剂盒置4℃保存（37℃），于保存后不同时间，按照AI-LFICA各个优化条件，对AIV阳性和阴性参考样品进行检测，并对结果进行统计学分析。

1.9 试剂盒应用试验取100份鸡咽喉拭子样品，用通用型AI-LFICA试剂盒和RT-PCR同时检测，比较结果。

2 结果

2.1 测定条件选择

2.1.1 标记量的选择把标记好的质量比（抗体/微球）不同的荧光微球稀释相同倍数，组装成检测卡，在检测卡加样孔中分别加入80μL参考样本，室温下层析15 min，检测，考察并验证不同标记量对标记结果的影响。结果表明，随标记抗体浓度的增加，各浓度点的结合率呈现先增后降的趋势，当抗体/微球的质量比为1∶25时曲线有拐点，以后渐平。因此，选择标记比例为1∶25的免疫微球进行后续实验。

2.1.2 加样量的选择在其他条件一致的情况下，考察并验证样本不同加样量对检测结果的影响。在检测卡加样孔里分别加入50、60、70、80、90、100、110μL参考样本，室温下反应15 min后检测。结果表明，随加样量的增加，各浓度点的结合率均增加。当样本加样量为80μL时，继续增加加样量，结合率增加不明显，认为此时试纸条上的免疫反应基本饱和。因此，后续实验选择80μL为样本加样量。

2.1.3 检测时间的选择在检测卡加样孔中加入80μL参考样本，室温下免疫反应，分别在5、10、15、20、25、30 min时检测，考察不同检测时间对结果的影响。结果表明，随检测时间的延长，各浓度点的结合率呈现增加的趋势，在15 min时检测能达到较高的结合率，而随着检测时间的延长，各浓度点的结合率不再发生较大的变化，趋于平稳或减少，说明在15 min时试纸条上的双抗体夹心吸附基本达到饱和。因此，本着快速简便的原则，选择检测时间为加样后15 min。

2.2 检测结果判读加样后，由于液体向前移动，先后与包被在T线和C线上的抗体形成复合物，这时试纸条经荧光检测设备扫描显示出2条荧光带。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中抗原浓度的增加而升高。相应的检测结果以浓度为横坐标，荧光值信号为纵坐标，经对数函数数据处理程序拟合得到标准曲线。当样本为阴性时，AIV浓度很低或无，T线荧光值很低或完全检测不到；当样本为阳性时，AIV抗原浓度越高，T线荧光值也越高。无论是阳性还是阴性结果，C线总能显示荧光，如果C线没有荧光显现，无论T线有无，这时的结果均判为无效。

2.3 AI-LFICA试剂盒的方法学评估

2.3.1 特异性试验用AI-LFICA试剂盒分别检测H9、H7、H5、H3亚型禽流感抗原，鸡新城疫（ND）和鸡传染性支气管炎（IB）阳性抗原，结果（表1）表明，AI（通用）-LFICA与所有亚型禽流感抗原均有反应，AI（H7）-LFICA只与H7亚型有反应；禽流感通用型和H7亚型LFICA与ND、IB阳性抗原均不发生交叉反应，显示出很好的特异性。

表1 特异性试验结果

2.3.2 敏感性试验当H7亚型抗原样本稀释至1 280倍时，用AI（H7）-LFICA检测仍为阳性（见 表2）。用AI（通用）-LFICA检测不同亚型阳性抗原样本时，不同亚型的稀释度不一样，最高是H5可达到5120倍，最低是H3为640倍（见表3）。证明该方法敏感性很好。

表2 禽流感H7亚型敏感性试验结果

表3 禽流感通用型敏感性试验结果

2.3.3 重复性试验选择不同浓度的8个H7阳性样本，用AI（H7）-LFICA检测10次，得出批内重复性试验的变异系数均小于10%；选取不同浓度的H9、H7、H5、H3阳性样本，用AI（通用）-LFICA分别检测10次，得出批内重复性试验的变异系数均小于10%。以上结果表明禽流感通用型和H7亚型LFICA试剂盒具有良好的重复性。

2.3.4 与HA、Bionote试纸条和荧光RT-PCR的比较试验同一份H9、H7、H5阳性样品，同时用AI-LFICA、HA、Bionote试纸条和荧光RT-PCR进行检测，结果表明，用荧光RT-PCR检测3种禽流感亚型的滴度达到或高于1∶40 960；AI-LFICA检测滴度优于HA，且检测H7的滴度明显优于Bionote试纸条（表4）。

表4 比较试验结果

2.3.5 试剂盒保存期试验用一批试剂盒于37℃放置一周，每天检测，经统计学分析得出，用AI-LFICA试剂盒检测阳性样品、阴性样品、P/N值的变异系数均小于10%，表明该产品很稳定。将该试剂盒放置于4℃，每月检测一次，目前已放置180 d，检测效果基本一致，说明该诊断试剂盒稳定有效，进一步的稳定性试验还在进行中。

2.3.6 试剂盒应用试验取100份鸡咽喉拭子样品，分别用通用型试剂盒和RT-PCR方法进行检测，得出共同阳性样品数为2份，共同阴性样品数为94份，由此得出两种方法的符合率为96%。

3 讨论

3.1 禽流感抗原检测方法中，中和试验是经典方法，但由于涉及细胞繁殖、病毒培养、染色标记等复杂操作，对实验仪器和操作人员要求较高，加上检测周期长，故很难在普通实验室应用。ELISA和RT-PCR是禽流感病毒抗原检测的主要方法，具有敏感性好和特异性强的优点，但需要比较完备的实验设备，操作人员也得具有一定的专业技术水平和经验，检测一批样品的整个流程至少需要2～4 h，对于基层兽医站和一般实验室不适用。本试验建立的高敏荧光免疫分析方法（LFICA）是在时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）基础上建立起来的一种超微量快速免疫检测技术，它集合了酶标记技术、放射标记技术和同位素标记技术的优点，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，无污染，测定范围宽，试剂盒寿命长，操作简单和非放射性等优点，已受到各领域科研工作者的关注。在人医学界已有文献报道，在兽医学领域才起步，需要研究的内容和范围还很多【1-3]。

3.2 本研究所用的单克隆抗体是整个试验的关键，单克隆抗体的质量、纯度、表位情况等对抗原的检测非常重要。对比试验结果表明，用荧光RT-PCR检测3种亚型禽流感抗原的效果最好；AI-LFICA检测滴度优于HA，且检测H7的滴度优于Bionote试纸条，基本能满足初筛需要。应用单抗建立的LFICA试剂盒对不同亚型抗原的检测滴度不同，这可能是由单抗的表位因素决定的，如果有多株单抗同时应用，效果会更加理想。本研究建立的AI-LFICA与郑腾等[4]和张险朋等[5的研究结果一致。

3.3 本研究建立的AI-LFICA，既具有胶体金免疫层析法（GICA）简单、方便、适于基层的优点，又具有ELISA和RT-PCR方法敏感、特异、微量的优点，检测时间从2～4 h缩短到十多分钟，检测不需要有经验的专业技术人员，检测设备小巧便于携带，尤其适用于基层兽医部门、养殖场和技术服务人员使用。