肺炎克雷伯菌临床分布及其碳青霉烯酶基因型检测分析

熊流新 陆丽苗

[摘要]目的 探討肺炎克雷伯菌临床分布特征及检测其碳青霉烯酶基因型，为完善本院分子流行病学资料提供理论依据。方法 对2015年1月～2017年12月本院患者送检的临床标本进行分离培养，采用BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析系统进行细菌鉴定及药敏分析，采用WHONET5.6进行临床分布及耐药性分析;对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌进行改良碳青霉烯类失活法试验（mCIM），PCR法检测碳青霉烯酶3种基因型（blaKPC、blaNDM、blaIMP），扩增产物使用BLAST软件分析;对mCIM试验结果与PCR结果进行一致性检验。结果 共分离888株肺炎克雷伯菌，标本来源主要是痰液595株（67.0%）、尿液86株（9.7%）、分泌物80株（9.0%）、血液71株（8.0%）;科室分布主要是新生儿科147株（16.6%）、呼吸科107株（12.0%）、普儿科103株（11.6%）、神经外科89株（10.0%）及ICU 73株（8.2%）。肺炎克雷伯菌对大多数抗菌药物存在不同程度的耐药，耐药率低于15%的只有亚胺培南、美罗培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦。对30株（3.4%）亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌进行mCIM试验，其中阳性29株（敏感性为96.7%）;30株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中有7株扩增阳性，检出均为blaNDM基因型（敏感性为23.3%），mCIM试验结果与PCR结果一致性Kappa值为0.766;与此同时无检出blaKPC、blaIMP基因型。结论 blaNDM基因型是本院肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶主要型别及对亚胺培南耐药的主要机制。

[关键词]肺炎克雷伯菌;碳青霉烯酶基因型;改良碳青霉烯类失活法;NDM基因型

[中图分类号] R978.11          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）7（c）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the clinical distribution of Klebsiella pneumonia and detect its carbapenemase genotypes， so as to provide a theoretical basis for improving the molecular epidemiological data of our hospital. Methods The clinical specimens sent to our hospital from January 2015 to December 2017 were isolated and cultured. The BIOFOSUN microbial identification drug sensitivity analysis system was used for bacterial identification and drug sensitivity analysis. The clinical distribution and drug resistance analysis were analyzed by WHONET5.6. The Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae was tested by modified carbapenem inactivation method （mCIM）， and three carbapenemase genotypes （blaKPC， blaNDM， blaIMP） were detected by PCR， PCR products were analyzed by BLAST software. The consistency of results between mCIM tests results and amplification results was analyzed by using BLAST software. The consistency test between the mCIM test results and the PCR results was performed. Results A total of 888 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated. The specimens were mainly 595 strains （67.0%） from sputum， 86 strains （9.7%） from urine， 80 strains （9.0%） from secretion， and 71 strains （8.0%） from blood. The departmental distribution was mainly 147 strains （16.6%） in neonatology， 107 strains （12.0%） in respiratory， 103 strains （11.6%） in pediatrics， 89 strains （10.0%） in neurosurgery， and 73 strains （8.2%） in ICU. Klebsiella pneumoniae was resistant to most antimicrobial agents in varying degrees， only Imipenem， Meropenem， Amikacin and Piperacillin/Tazobactam with antimicrobial resistance rates below 15%. All 30 （3.4%） strains of Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae were tested by mCIM， and 29 strains were positive （the sensitivity was 96.7%）. Seven of the 30 strains of Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae were positively amplified， and all of them were detected as blaNDM genotype （sensitivity was 23.3%）. The Kappa value for consistency of mCIM tests results and PCR results was 0.766， at the same time blaKPC or blaIMP genotypes were not detected. Conclusion The blaIMP is the major genotype of carbapenemase in our hospital and the main mechanism for Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae.

[Key words] Klebsiella pneumoniae; Carbapenemase genotypes; Modified carbapenem inactivation method; NDM genotype

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是革兰阴性杆菌，属于肠杆菌科的重要成员，可引起肺炎、败血症及泌尿系统感染等[1]。随着临床大量使用广谱抗生素，多重耐药肺炎克雷伯菌（multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae，MDRKP）菌株导致的临床抗感染治疗的困扰已经被广泛报道。魏泽庆等[2]研究表明，MDRKP感染有着较高的发病率和死亡率，是院内感染患者死亡的独立危险因素。与此同时，MDRKP感染可以引起医院感染小范围的流行，其不断增长趋势引起了临床的极大关注[3-4]。MDRKP感染患者的临床治疗药物选择存在诸多限制，碳青霉烯类抗菌药物被认为是临床治疗革兰阴性杆菌感染的最后一道防线[5]。在抗生素选择性压力下，KPN可以通过基因突变获得耐药质粒并携带多种耐药基因对抗菌药物产生耐药性，产碳青霉烯酶是耐碳青霉烯酶类抗菌药物最突出的機制[6]。碳青霉烯酶可分为A、B、D三种，其中A、D类属于丝氨酸酶（包括KPC、IMI、NMC-A、SME等），B类属于金属酶（包括NDM、IMP、VIM、SIM等）。碳青霉烯酶可以直接水解灭活大多数β-内酰胺类（包括碳青霉烯酶类）和多种非β-内酰胺类抗菌药物，产碳青霉烯酶KPN（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）菌株在近年全球多个国家及地区检出率呈上升的趋势，使临床抗感染治疗受到巨大挑战[7]。为了及时监测KPN分布特征及碳青霉烯类基因型流行状况，本研究对本院分离的888株KPN进行临床分布及耐药性进行分析，并对其中30株CRKP采用mCIM试验及PCR法检测3种常见的碳青霉烯酶基因型（blaKPC、blaNDM、blaIMP），现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源  收集2015年1月～2017年12月本院的888株KPN，排除同一患者同一部位重复分离菌株，本研究获医院医学伦理委员会审核批准。

1.1.2质控菌株及仪器  BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析系统购自上海复兴医药有限公司;抗菌药敏纸片购自OXOID公司;LB肉汤、TSB肉汤、血平板、Mueller-Hinton Agar（MHA）平板购自广州迪景公司;Omega小抽试剂盒购自美国Omega生物科技公司;PCR仪器购自Bio-Rad公司;质控菌株：KPN ATCC700603、大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218均购自广东省临床检验中心;产碳青霉烯酶菌株17Kpe17（ST型431）来源于肇庆市疾病控制中心惠赠。

1.2方法

1.2.1临床分布及药敏分析  细菌分离培养严格按照《全国临床检验操作规程》进行，采用BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析系统进行细菌鉴定及药敏试验。采用WHONET5.6软件对原始数据进行统计分析，细菌药敏标准依据CLSI-100M-S27文件进行判断。

1.2.2 mCIM试验检测KPN中的碳青霉烯酶  将耐亚胺培南的30株KPN株编号S1-S30，从-70℃冰箱取出复苏，按文献[8]方法进行mCIM试验。mCIM试验结果解释：美罗培南纸片抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm但抑菌圈内有散在菌落，证明纸片中的美罗培南被碳青霉烯酶降解，表现为无抑菌圈或抑制大肠埃希菌ATCC25922的活性降低，即判断为阳性;美罗培南纸片抑菌圈直径≥19 mm，纸片中的美罗培南不被碳青霉烯酶水解，仍能抑制大肠埃希菌ATCC25922的生长，即判断为阴性;美罗培南纸片抑菌圈直径为16～18 mm，或直径为≥19 mm抑菌圈内有散在菌落，即判断为中介。

1.2.3 PCR法检测碳青霉烯酶基因型  参照文献[9]基因序列设计blaKPC、blaNDM、blaIMP基因引物，由上海生工生物工程有限公司合成，具体见表1。参考Omega小抽试剂盒提取DNA作为PCR反应模板，具体步骤参照说明书及相关文献[10]，PCR反应体系为25 μl（2×PCR Mix 12.5 μl，上下引物各1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O加至25 μl），PCR反应条件为94℃预变性10 min，94℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸60 s，35个循环，72℃延伸7 min。PCR完成后吸取5 μl至1.5%琼脂糖凝胶进行电泳（恒压100 V），电泳60 min后，在凝胶成像仪下观察不同的泳道blaKPC（798 bp）、blaNDM（621 bp）、blaIMP（232 bp）是否存在特异性条带。将PCR阳性产物送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序，测序后序列采用DNA Star软件校正，登陆NCBI官网（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列对比分析。

1.2.4 mCIM试验与PCR结果一致性统计分析  Kappa值<0.40代表一致性程度较差;Kappa值在0.40～0.75代表一致性程度一般;Kappa值>0.75代表一致性程度较好。

2结果

2.1 KPN临床分布

2015年1月～2017年12月本院送检标本检出KPN 888株，其中2015年243株，2016年258株，2017年387株，呈现逐年上升趋势;在送检标本中，主要是痰液（67.0%）、尿液（9.7%）、分泌物（9.0%）、血液（8.0%），脓液及其他标本也有检出，具体见表2。KPN科室主要分布于新生儿科147株（16.6%）、呼吸科107株（12.0%）、普儿科103株（11.6%）、神经外科89株（10.0%）、ICU 73株（8.2%），其他科室也有不同程度检出，具体见表3。KPN对大多数抗菌药物产生一定程度耐药，耐药率低于15%的只有亚胺培南、美罗培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦，具体见表4。其中CRKP 30株（3.4%），2015年4株，2016年13株，2017年13株。

2.2 mCIM试验结果

对30株CRKP进行mCIM试验，共检出29株mCIM试验结果阳性（敏感性为96.7%）（图1）;其中1株CRKP mCIM实验结果阴性（编号S17），该菌落特征为高黏液表型，菌液极难调制，导致mCIM实验阴性的具体原因有待进一步研究（阴性对照为KPN ATCC700603，阳性对照菌株产碳青霉烯酶菌株17Kpe17，ST型431）。

2.3 PCR扩增结果

30株CRKP中有7株PCR扩增阳性产物大少与blaNDM产物大少基本一致（621 bp）（图2）。PCR阳性产物送上海生工公司进行双向测序，测序后序列与GenBank已报道的序列进行对比，证实是blaNDM基因。30株CRKP均无扩增出blaKPC、blaIMP预期片段。对编号S17的CRKP菌株进行PCR扩增，3种碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP）均为阴性。

2.4 mCIM试验结果与PCR结果一致性检验

对30株（3.4%）亚胺培南耐药的KPN进行mCIM试验，其中阳性29株（敏感性为96.7%）;30株CRKP有7株扩增阳性，检出均为blaNDM基因（敏感性23.3%）。mCIM试验与PCR结果一致性检验Kappa值为0.766，一致性程度较好。

3讨论

本研究结果显示，2015年1月～2017年12月本院KPN检出率呈现上升趋势，并存在部分科室聚集的现象。主要集中于新生儿科（16.6%）、呼吸科（12.0%）、普儿科（11.6%）、神经外科（10.0%）和ICU（8.2%），标本来源主要是痰液（67.0%）、血液、分泌物、尿液及其他标本也有一定分布。KPN是导致呼吸道相关感染的重要条件致病菌，这与文献报道一致[11]。本研究结果还显示，KPN对大多数抗菌药物存在不同程度的耐药，耐药率<15%的抗菌药物只有亚胺培南、美罗培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦，但与此同时个别抗菌药物耐药性有下降趋势，如阿米卡星从2015年的耐药率为10.0%，2016年的耐药率为5.8%，2017年的耐药率为1.0%;左旋氧氟沙星2015年的耐药率为20.7%，2016年的耐药率为20.5%，2017年的耐药率为10.6%。陈淼等[12]研究表明，细菌临床分布及其耐药性在不同的地区有着不同的特点，这与该医院常用抗菌药物的使用强度、侵入性治疗开展情况和当地人群的易感性等因素密切相关。近年本院推行了严格的抗菌药物分级管理，定期组织临床药师开展临床一线查房并对重点患者实施药学监护，院感部门对耐药菌群进行连续监测和对多重耐药菌定植或感染的患者进行隔离治疗，对指导临床合理使用抗生素和切断耐药菌传播途径有着积极的意义。

本研究结果提示，对亚胺培南耐药KPN共30株（3.4%），采用mCIM试验同时结合PCR法检测碳青霉烯酶3种基因型（blaKPC、blaNDM、blaIMP），其中mCIM试验结果阳性共29株（敏感性为96.7%），PCR结果阳性显示有7株，产物大少与blaNDM大少（621 bp）基本一致，将PCR产物送上海生工有限公司进行双向测序并与GenBank已报道的序列对比，最终证实是blaNDM基因。7株PCR扩增阳性的菌株，mCIM试验结果均为阳性。對mCIM试验结果和PCR试验结果进行一致性检验，两者一致性较高（Kappa值为0.766）。mCIM试验具有操作简单、所需耗材少和结果可靠等特点，可以作为临床微生物室CRKP常规筛查手段。本研究中1株CRKP（编号S17），菌落形态为高黏液表型，mCIM试验与PCR结果均为阴性。Goodman等[13]研究分析，该菌可能为非产碳青霉烯酶型菌株，由于存在AmpC酶伴外膜蛋白缺失、外排泵高表达及亲和性结合位点缺失等因素造成的结果。

KPN是医院内感染的重要条件致病菌，可以通过接触、空气等多种途径传播，MDRKP的感染流行已经成为全球关注的重大卫生安全问题[14]。临床不合理使用抗菌药物可诱导KPN菌株产生耐药性，KPN的耐药机制包括质粒或染色体介导的产超广谱-内酰胺酶（ESBLs）、氨基糖苷类修饰酶灭活作用、DNA拓扑异构酶导致抗菌药物作用靶位改变、细菌对抗菌药物的外排机制及细菌的生物膜形成等，其中产碳青霉烯酶是KPN对碳青霉烯类耐药的主要原因[15]。值得注意的是，本研究发现了产ESBLs的KPN菌株同时对碳青霉烯类耐药，编码耐碳青霉烯类耐药基因与编码产ESBLs耐药基因并存，这给临床抗感染治疗带来极大考验。自2009年Timothy R. Walsh教授研究团队首次报道NDM基因后，许多国家和地区都有相关的报道，NDM基因可通过质粒在不同细菌间传播，产生的碳青霉烯酶能直接水解亚胺培南等抗菌药物，称为“NDM超级耐药菌”，已经引起临床的高度关注[16-17]。本研究结果检出均为blaNDM基因型，与谢思等[18]研究的广州军区广州总医院以携带KPC-2型基因型为主结果不同。本研究通过调查CRKP患者流行病学资料发现，30株中有11株的患者有曾经到外地三甲医院住院治疗的经历，这11株CRKP在肇庆地区流行传播所起的作用仍需进一步研究分析。

终上所述，本院KPN检出率呈现逐年增高趋势并散发出现产碳青霉烯酶菌株，携带blaNDM基因型碳青霉烯酶是本院KPN对亚胺培南耐药的重要机制。临床应该对此情况予以高度重视，严格控制碳青霉烯类抗菌药物的使用，以防止此类菌株越来越多。

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（收稿日期：2019-04-01  本文编辑：任秀兰）