精子DNA碎片、弹性硬蛋白酶及精液参数与孕早期流产相关性的前瞻性研究

张俊　钟诚　查钱江

【摘要】 目的：探討孕早期流产是否与精子DNA碎片化指数（DFI）、精浆弹性硬蛋白酶、精子形态、精子动力学参数有关。方法：选取2016年12月-2019年2月于本院生殖中心行人工授精（IUI）或体外受精胚胎移植（IVF-ET）的男性患者120例，根据术后配偶妊娠情况，将其分为IUI分娩组、IUI流产组、IVF分娩组、IVF流产组，各30例。比较各组精子浓度、前向运动精子百分率、精子形态学检查结果、精浆弹性硬蛋白酶、精子DFI。结果：IUI流产组和IUI分娩组精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;IVF流产组和IVF分娩组精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;IUI流产组、IVF流产组精浆弹性硬蛋白酶及精子DFI均分别高于IUI分娩组、IVF分娩组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

结论：孕早期流产与精浆弹性硬蛋白酶、精子DFI高有关，与精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率无关。

【关键词】 孕早期流产; 精子DNA碎片化指数; 弹性硬蛋白酶

Prospective Study on the Relationship between Sperm DNA Fragments，Elastoproteinase and Semen Parameters and Early Pregnancy Abortion/ZHANG Jun，ZHONG Cheng，ZHA Qianjiang.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：0-018

【Abstract】 Objective：To explore whether early pregnancy abortion is related to sperm DNA fragmentation index（DFI），seminal plasma elastoproteinase，sperm morphology and sperm dynamics parameters.Method：A total of 120 male patients undergoing artificial insemination（IUI）or in vitro fertilization and embryo transfer（IVF-ET）in the reproductive center of our hospital from December 2016 to February 2019 were selected.According to the pregnancies of spouses after operation，they were divided into IUI delivery group，IUI abortion group，IVF delivery group and IVF abortion group，30 cases in each group.The sperm concentration，forward motility sperm rate，sperm morphology，seminal plasma elastoproteinase and sperm DFI in four groups were compared.

Result：There were no significant differences between IUI abortion group and IUI delivery group in sperm concentration，forward motility sperm rate and normal morphology sperm percentage（P>0.05）.There were no significant difference between IVF abortion group and IVF delivery group in sperm concentration，forward motility sperm rate and normal morphology sperm percentage（P>0.05）.The seminal plasma elastoproteinase and sperm DFI in IUI abortion group and IVF abortion group were higher than those of IUI delivery group and IVF delivery group respectively，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Early pregnancy abortion is associated with high seminal plasma elastoproteinase and sperm DFI，but not with sperm concentration，sperm motility and normal sperm percentage.

【Key words】 Early pregnancy abortion; Sperm DNA fragmentation index; Elastoproteinase

First-authors address：Central Peoples Hospital of Huizhou，Huizhou 516001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.004

复发性流产是育龄妇女的常见病[1]。目前复发性流产的病因研究主要集中在女性，而对于男性因素的研究很少[2-3]。但是精子因素与胚胎质量密切相关，男性因素与流产的内在联系目前不是很清楚，值得深入研究[4]。本研究试图通过比较人工授精（IUI）、体外受精胚胎移植（IVF-ET）两种不同助孕方式后正常分娩组与配偶孕早期流产组的男性相关指标，分析孕早期流产是否与精子DNA碎片化指数（DFI）、精浆弹性硬蛋白酶、精子形态、精子动力学参数有关。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年12月-2019年2月于本院生殖中心行IUI或IVF-ET的男性患者120例，平均年龄（35.2±2.8）岁。纳入标准：20～40岁男性;配偶体健;以男方因素行IUI或IVF者。排除标准：先天性生殖系统发育畸形、内分泌异常、染色体异常、精索静脉曲张，或近6个月内有高热史、泌尿生殖道急性感染者;配偶怀孕后因外力因素导致流产者。根据术后配偶妊娠情况，将其分为IUI分娩组（IUI术后配偶正常分娩）、IUI流产组（IUI术后配偶孕早期自然流产）、IVF分娩组（IVF-ET术后配偶正常分娩）、IVF流产组（IVF-ET术后配偶孕早期自然流产），各30例。本研究已经医院伦理学委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液参数检测 患者留取标本前禁欲2～7 d，参照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册（第5版）》的标准，检测精液体积、pH值、浓度、前向运动精子率;精子形态学检测采用改良巴氏染色法，严格按标准评估精子的形态。

1.2.2 精浆弹性硬蛋白酶浓度测定 新鲜标本液化后立即取部分标本3 000 g离心15 min，留取精浆用Eppendorf管分装数支后，-20 ℃保存。使用精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂盒（深圳市博锐德生物科技有限公司），按常规流程检测精浆弹性硬蛋白酶。

1.2.3 精子DFI检测 采用精子染色质扩散（SCD）法，使用Halosperm试剂盒（Halotech公司）。按照常规流程操作，在高倍光镜下观察500个精子，根据Fernandez标准分级，大晕环和中晕环表示精子DNA完整无损伤，小晕环、无晕环、退化精子表示精子DNA损伤。DFI=DNA损伤精子数/精子总数×100%。

1.3 观察指标 观察并比较各组精子浓度、前向运动精子百分率、精子形态学检查结果、精浆弹性硬蛋白酶、精子DFI。

1.4 统计学处理 使用SPSS 24.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用F检验，两组间比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 四组一般资料比较 IUI分娩组、IUI流产组、IVF分娩组、IVF流产组平均年龄分别为（35.8±3.1）、（36.2±3.3）、（34.4±3.2）、（25.1±2.1）岁，组间比较，差异无统计学意义（F=3.018，P>0.05）。

2.2 四组精液参数比较 IUI流产组和IUI分娩组精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;IVF流产组和IVF分娩组精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1、2。

2.3 四组精浆弹性硬蛋白酶的检测结果比较 IUI流产组、IVF流产组精浆弹性硬蛋白酶及精子DFI均分别高于IUI分娩组、IVF分娩组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3、4。

3 讨论

在过去数十年的调查中，健康男性的精液质量，包括精液含量、精子浓度及活动力和形态正常精子比例都逐渐恶化，且精子浓度平均每年降低2.1%，显见男性精液质量逐渐恶化中。生活习惯、环境、生理状态及基因都会影响精子功能，进而造成男性不育[3]。目前治疗不孕症的患者，临床使用的方法即IUI或IVF-ET，使患者达到受孕的目的。然而，精子质量的好坏会直接影响到体外受精的成功率，因此，最根本的方法即为提升男性精子质量。精子的细胞膜上富含多元不饱和脂肪酸，容易受氧化物质（ROS）攻击而脂质过氧化，使脂质氧化产物-丙二醛升高及DNA受损，且使前向运动精子率衰退，ATP生成下降，线粒体膜电位降低，进而使精子与卵结合能力下降。

精卵结合形成胚胎，胚胎的质量不仅与卵子相关，也与精子质量密切相关[5-6]。从理论上推测，流产与精子质量存在密不可分的关系。精液常规分析是男性不育患者常用的检查项目，但有其局限性，仅能从宏观上判断精子的理化特征，很难从分子生物水平上反映精子的质量和精浆的异常变化，因此急需找到其他的检测指标来辅助判断精液的质量，判断精液与流产的关系。

精子染色体虽然被鱼精蛋白紧密包裹，但仍然不能避免DNA受到不良影响。精子的DNA携带着重要的遗传信息，在漫长的生成和成熟过程中，在很多不良因素的影响下，均可能发生DNA损伤[7-10]。

比如外部暴露、年龄老化、电离辐射、空气污染及其他环境暴露均已被证实可能导致精子DNA碎片增加，而是否会进一步影响妊娠结局，是否与胚胎丢失率有关成了近期的热点论题[11-17]。本研究结果显示，IUI流产组、IVF流产组精子DFI均分别高于IUI分娩组、IVF分娩组，差异均有统计学意义（P<0.05），证实了上述结论，其机制可能与DNA损伤后，引起某些蛋白合成不足，或某些遗传物质稳定性下降有关，需要在以后的研究中进一步阐明。

弹性硬蛋白酶分布于中性粒细胞、巨噬细胞等细胞和组织中，其浓度与炎性细胞数呈正比，可作为静止型生殖道感染的诊断及愈后检测指标[18]，临床上主要用于检查男性生殖道感染，根据检测试剂不同，其参考范围有所不同，浓度越高，感染越严重。当生殖道感染时，炎性细胞可通过吞噬、产生活性氧及分泌多种细胞因子等方式损伤精子，造成精子成熟和精子功能障碍，甚至成为胚胎质量的潜在隐患，可能与流产等不良妊娠结局有关系[19-20]，为生殖道感染的敏感性指标。本研究结果显示，IUI流产组、IVF流产组精浆弹性硬蛋白酶均分别高于IUI分娩组、IVF分娩组，差异均有统计学意义（P<0.05），证实了上述结论，但尚需在以后的工作中，结合细菌培养等微生物学检测指标进一步明确其具体机制。

以往关于男性因素与流产的相关性研究中，大都是配偶流产后，再检测男性精子相关指标，此时的精液质量无法代表精卵结合前的精子质量。本研究采用随机对照的研究方法，所有病例都完整收集了从初诊到进入IUI或IVF助孕周期的检测结果，记录了随访的妊娠结局。与以往研究不同的是，本研究在IUI、IVF-ET的术前，已经对患者的精液质量做了详细的检测并详细记录，而这些在精卵结合之前做的精液相关检测数据与最终的妊娠结局是密切相关的。

综上所述，笔者考虑孕早期流产与精浆弹性硬蛋白酶、精子DFI高有关，与精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率无关。

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