儿童重症肺炎链球菌肺炎的感染状况、耐药性及血清型研究

孔程祥　王飞玲　李莉　金萍　吴丽娟　谢红波

【摘要】 目的：分析儿童重症肺炎链球菌肺炎的感染状况、血清学分型及耐药现状，为预防和控制肺炎链球菌感染提供依据。方法：回顾性分析2013年6月-2018年6月笔者所在医院PICU收治的重症肺炎链球菌肺炎患儿的临床资料，进行病原菌培养及药敏试验，并采用多重PCR对肺炎链球菌血清型体系进行检测。结果：共分离出肺炎链球菌86株（28.86%），位居首位;对抗菌药物的耐药率总体呈上升趋势，对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明均有较高的耐药性，多数肺炎链球菌对青霉素类、头孢类药物敏感，对万古霉素、利奈唑胺的耐药率为0，未发现对喹诺酮类药物耐药;血清学分型检测以19F（29.07%）、23F（15.12%）、6型（15.12%）和19A（11.63%）为主。结论：肺炎链球菌仍是本地区儿童重症肺炎的主要病原菌，耐药问题日益显著，应正确合理使用抗生素，有效提高儿童重症肺炎的救治成功率。

【关键词】 儿童; 重症肺炎; 肺炎链球菌; 耐药性; 血清型

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.20.021 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）20-00-03

Study on Infection Status，Drug Resistance and Serotype of Severe Streptococcus Pneumoniae Pneumonia in Children/KONG Chengxiang，WANG Feiling，LI Li，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（20）：-52

【Abstract】 Objective：To analyze the infection status，serological classification and drug resistance of severe Streptococcus pneumoniae infection in children，so as to provide evidence for the prevention and control of Streptococcus pneumoniae infection.Method：The clinical data of children with severe Streptococcus pneumoniae admitted to PICU from June 2013 to June 2018 were analyzed retrospectively.The pathogen culture and drug sensitivity test were carried out，and the serotype system of Streptococcus pneumoniae was detected by multiplex PCR.Result：A total of 86 strains（28.86%） of streptococcus pneumoniae was isolated，ranking the first.The drug resistance rate of antibiotics was on the rise，and erythromycin，clindamycin，tetracycline and SMZ were all highly resistant.Most streptococcus pneumoniae were sensitive to penicillin and cephalosporins，while vancomycin linezolid and quinolones had no resistance.Serotype was mainly composed of 19F（29.07%），23F（15.12%），type 6（15.12%），and 19A（11.63%）.Conclusion：Streptococcus pneumoniae is still the main pathogen of severe pneumonia in children in our region，and drug resistance is becoming increasingly significant.Therefore，antibiotics should be used correctly and rationally to effectively improve the success rate of treatment for severe pneumonia in children.

【Key words】 Children; Severe pneumonia; Streptococcus pneumoniae; Drug resistance; Serological typing

First-authors address：Shenzhen Baoan Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen 518106，China

社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是全球5岁以下儿童死亡的重要原因，细菌感染是主要原因之一，据统计，肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是引起CAP的主要细菌。本文通过总结笔者所在医院不同时期儿童重症肺炎链球菌肺炎的感染状况、细菌血清型，并分析其对抗菌药物的耐药性，为儿童重症肺炎链球菌肺炎得到有效预防和治疗，并减少多重耐藥菌株的产生提供有力依据，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2013年6月-2018年6月在笔者所在医院PICU住院治疗的469例儿童重症肺炎患者为研究对象，所有患者均符合小儿重症肺炎的诊断标准[1]。其中男320例，女149例，0～1岁339例，1～3岁93例，3～7岁34例，7岁以上3例。所有菌株均为连续分离的非重复株，同一患儿只取其第一次分离的菌株。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和送检 所有重症肺炎患儿的痰（或肺泡灌洗液）标本均在患儿入住PICU并确诊为重症肺炎时采集。痰液标本采集前均给予清洁口腔后诱导吸痰，肺泡灌洗液的取材均为经消毒过的纤维支气管镜在无菌操作下取得，所有标本均装入无菌痰标本杯内中密封送检。

1.2.2 菌株的分离培养和鉴定 将采集的标本分别接种于哥伦比亚血琼脂平板、嗜血巧克力平板和麦康凯平板上，放于35 ℃、5% CO2培养箱培养。对可疑肺炎链球菌菌落采用手工法奥普托欣试验或质谱仪MALDI-TOF Biotyper（德国bruker公司）进行细菌鉴定。具体操作流程按照《全国临床检验操作规程》执行。

1.2.3 药敏试验 肺炎链球菌采用Kirby-Bauer（K-B）法纸片扩散法对青霉素、头孢曲松、万古霉素、四环素、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星和复方新诺明等抗菌药物（英国OXOID公司产品）进行体外药敏试验，药敏平板选用M-H血琼脂平板（温州市康泰生物科技有限公司产品），操作和结果判读依据美国临床实验室标准委员会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）每年更新的抗菌药物敏感性标准。

1.2.4 血清学分型 采用多重PCR对SP血清型进行检测，将冻存的SP菌种复苏转至哥伦比亚血平板（广州迪景），置35 ℃、5% CO2温箱培养24 h，获得新鲜SP菌落。按以下步骤进行检测：（1）引物设计。参照文献[2]对PCR引物，包括SP荚膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9V、14、18、19A、19F、23F特异性引物，由Invitrogen公司合成。（2）DNA提取和PCR扩增。将新鲜纯SP菌落刮入1 ml生理盐水，按Axygen细菌基因组DNA小量提取试剂盒（柱提取法）步骤提取模板DNA。PCR反应体系为ExTaqDNA聚合酶0.1 μl，10×ExTaq buffer 2 μl，模板DNA 2 μl，dNTPs 1.6 μl，9种混合引物（每种引物200 μm）

0.75 μl，重蒸水补足至20 μl。循环参数：94 ℃ 15 min，94 ℃

30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶电泳成像系统观察产物条带。（3）DNA测序。在紫外灯下切割有条带的胶块，按DNA纯化试剂盒说明书对DNA 进行纯化后，按TA载体试剂盒说明书与pMD18-T载体进行连接，平板克隆。完成后送华大基因公司测序，测序结果经Blast检索与GenBank数据库进行同源性比较分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，将所有数据录入SPSS 22.0内，对其采用频数分析法进行数据的统计与分析。

2 结果

2.1 肺炎链球菌检出情况

469例患儿共采集标本1 185份，阳性标本273份，细菌检出率为23.04%（273/1 185）;其中72份标本为肺泡灌洗液，

1 113份标本为痰液;少数标本查出混合菌感染，最终共培养出298株病原菌。其中前五位细菌分别为：肺炎链球菌（86/298，占28.86%）、流感嗜血杆菌（71/298，占23.83%）、金黃色葡萄球菌（39/298，占13.09%）、肺炎克雷伯菌（22/298，占7.38%）、大肠埃希菌（20/298，占6.71%）。其他细菌数量相对较少，分别为鲍曼不动杆菌（15/298，占5.03%）、铜绿假单胞菌（10/298，占3.36%）、卡他布拉汉氏菌（7/298，占2.35%）、阴沟肠杆菌（5/298，占1.68%）、洋葱伯克霍尔德氏菌（5/298，占1.68%）、肠杆菌科（4/298，占1.34%）、产气肠杆菌（3/298，占1.01%）;医院不动杆菌、产酸克雷伯菌均只有2株（占0.67%）;而阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌、粘金黄杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、脑膜炎败血性黄杆菌、解尿氨酸克雷伯菌、粪肠球菌均仅有1株

（占0.34%）。

2.2 抗菌药物耐药性检测结果

肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明均有较高的耐药性，且呈逐年上升趋势;多数肺炎链球菌对青霉素类、头孢类药物敏感，对万古霉素、利奈唑胺的耐药率为0，未发现对喹诺酮类药物耐药，见表1。

2.3 血清学分型结果

86株临床分离的肺炎链球菌中，检出19F最多，占29.07%（25株），其次为23F，占15.12%（13株），6型占15.12%（13株），19A型占11.63%（10株），其他为：15B型占4.65%（4株），14型占2.33%（2株），15A、18型、9V、4型各占1.16%（1株），另外检出两种血清型混合感染占11.63%（10株），未检出相关血清型5.81%（5株）。

3 讨论

肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是人类最早认识的革兰阳性双球菌，人群对其普遍易感，全球儿童肺炎链球菌的感染率及感染相关病死率高。据报道，据世界卫生组织（WHO）估计，2008年全球5岁以下儿童死亡约880万例，5%死于肺炎链球菌性疾病（pneumococcal diseases，PD）[3];2010年WHO估计全球全年5岁以下肺炎链球菌肺炎患儿共258.50万例，占全球5岁以下肺炎患儿的18.30%，儿童肺炎链球菌肺炎现况不容乐观。

本研究发现笔者所在医院儿童重症肺炎以肺炎链球菌感染为首，与陆芸芸等[4]报道的重症肺炎患儿细菌检出以流感嗜血杆菌为首不同，与刘霞等[5]报道的重症肺炎患儿细菌检出以肺炎克雷伯菌为首亦不相同，也不完全等同于De Schutter等[6]报道的肺炎以流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌为主要细菌病原，提示不同地域、不同病情，肺炎病原菌普可发生不同的变迁。准确掌握本地区重症肺炎病原菌普的变迁情况，可指导临床医生选择有效抗生素，有助于提高重症肺炎的抢救成

功率。

通过本研究发现，肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明等药物耐药性较高，与李立群等[7]报道一致，也可能与大环内酯类药物不合理使用有关。多数肺炎链球菌对青霉素类、头孢类药物还是比较敏感的，笔者尚未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药的菌株，与国内其他报道类似[8]。但国外Sanaei等[9]报道肺炎链球菌对万古霉素的耐药率为1.5%。总的来说，肺炎链球菌的耐药菌率是呈上升趋势的，临床工作中应予以重视。

现实中肺炎链球菌存在90多种血清型，具有强大的致病力和定植力，决定血清型特异性的是其细胞外包绕的荚膜多糖，也是最重要的毒力因子和致病关键，可作为宿主抗体的作用靶点，这也是疫苗应用的基础。肺炎链球菌的血清型与其致病性、耐药性和疫苗有效性等均密切相关，是防治种肺炎链球菌相关性疾病（pneumococcal disease，PD）相关研究的核心。多项研究显示肺炎链球菌多重耐药菌在全球广泛流行，亚洲国家最显著，我国则高达80%～90%[10]。本研究发现，笔者所在医院肺炎链球菌感染引起的儿童重症肺炎，血清学分型以19F为主，这与陈巧君等[11]报道较为类似，也与欧美发达国家广泛应用PCV疫苗之前的结果及亚洲多个国家监测结果相似[12]，但与王启等[13]有关报道略有不同，与李晓等[14]有关报道亦有不同;Xue等[15]对中国儿童171株侵袭性肺炎链球菌菌株采用传统方法检测血清型结果显示以19 F、14、19A、未检出型、6、23F为主，与本文亦略有差异，这说明肺炎链球菌的血清型分布存在地区差异，具有区域性。可能与各地区人群的组成、疫苗的接种情况不同有关。

SP的血清型分布流行特点具有地域、年龄差别，并随时间、环境变迁、人群流动、抗菌素压力、细菌进化和重组等多种因素出现不同时期流行血清型的飘移[16]，因此，持续监测SP的血清型流行分布及改变特征，与研究SP的致病机制、耐药性传播、血清型置换等实验和临床研究都息息相关，对防治PD具有重要的流行病学意义。

综上所述，肺炎链球菌仍是本地区儿童重症肺炎的主要病原菌，血清型分类以19F为主，肺炎链球菌临床耐药问题值得大家关注，应提高肺炎链球菌的鉴定能力，及早发现，正确合理使用抗生素，有效提高儿童重症肺炎的救治成功率。

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