哇巴因对肝癌细胞株P-gp表达的影响研究

杨明镇　赵逵

【摘要】 目的 研究哇巴因对肝癌细胞株P-糖蛋白（P-gp）表达的影响。方法 选用人肝癌Bel-7402细胞株， 阿霉素（ADM）大剂量间断冲击法建立Bel-7402/ADM模型并设为耐药组， 正常Bel-7402设为对照组。采用免疫印迹（WB）检测两组哇巴因干预前后P-gp表达水平。结果 哇巴因干预前， 耐药组P-gp表达水平为（72.68±0.07）， 对照组为（22.21±0.04）;哇巴因干预后， 耐药组P-gp表达水平为（20.61±0.04）， 对照组为（14.32±0.05）;哇巴因干预后， 两组P-gp水平均显著低于哇巴因干预前， 差异有统计学意义（P<0.05）;哇巴因干预前后耐药组P-gp水平均显著高于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 哇巴因可有效下调肝癌细胞株P-gp的表达。

【关键词】 哇巴因;肝癌细胞株;P-糖蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.107

Effect of ouabain on the expression of P-gp in hepatocellular carcinoma cell line   YANG Ming-zhen， ZHAO Kui. Department of Invasive Technology， Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Zunyi 563003， China

【Abstract】 Objective   To study the effect of ouabain on the expression of P-glycoprotein （P-gp） in hepatocellular carcinoma cell line. Methods   The Bel-7402/ADM model of human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 was established by high-dose intermittent impulse method with adriamycin （ADM） as drug-resistant group and normal Bel-7402 as control group. The expression of P-gp was detected by Western blotting （WB） before and after ouabain intervention in the two groups. Results   Before intervention of ouabain， drug-resistant group had P-gp expression level as （72.68±0.07）， which was （22.21±0.04） in the control group. After intervention of ouabain， drug-resistant group had P-gp expression level as （20.61±0.04）， which was （14.32±0.05） in the control group. After intervention of ouabain， both groups had significantly lower P-gp expression level than those before intervetion of ouabain， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Before and after intervention of ouabain， drug-resistant group had significantly higher P-gp expression level than the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   Ouabain can effectively down-regulate the expression of P-gp in hepatocellular carcinoma cell line.

【Key words】 Ouabain; Hepatocellular carcinoma cell line; P-glycoprotein

肝癌（liver  cancer）是指發生于肝脏或从肝脏开始的恶性肿瘤， 使机体基因转录异常， 细胞失去正常增殖、分化、凋亡能力[1]。肝癌发病隐蔽， 初期无明显症状， 病情进展迅速， 临床症状多表现为发热、乏力、纳差、消瘦、消化道症状及最常见的肝区疼痛， 多因癌细胞迅速生长致肝包膜紧绷导致， 疼痛可辐射至右肩[2]。体征常见肝脾肿大、腹水黄疸等。肝癌确诊时患者往往已到晚期或已发生转移， 大多数患者无法通过手术根治， 预后差， 复发率高。化疗是目前最主要治疗手段[3]， 长时间使用化疗药物易导致肿瘤多药耐药性（multidrug resistance， MDR）[4]， 影响药物吸收， 制约疗效， 危害患者身心健康。研究表明， P-糖蛋白（P-glycoprotein， P-gp）是MDR基因编码的一种跨膜转运蛋白， 参与机体解毒及代谢， 可将细胞内毒性代谢产物外排出细胞， 保护细胞受损。临床上对哇巴因干预下P-gp表达影响研究较少， 因此本文旨在探讨哇巴因对肝癌细胞株P-gp表达的影响， 期望为临床治疗提供实验和理论依据， 现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 主要药物及试剂 人肝癌Bel-7402细胞株（上海冠导生物工程有限公司）;ADM（湘潭嘉叶源生物科技有限公司）;胎牛血清（FBS）（北京雅安达生物技术有限公司）;细胞裂解液（北京智杰方远科技有限公司）;聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（上海邦景实业有限公司）;预染标准分子量蛋白 （上海谷研实业有限公司）。

1. 2 实验模型制备及分组 取对数生长期人肝癌Bel-7402细胞， 0.25%胰酶消化， 1000 r/min离心3 min后收集细胞。在37℃、5% CO2、0.1 μmol/L浓度ADM条件下染毒1 h后， 0.25%胰酶消化， 1000 r/min离心3 min收集细胞， 在不加ADM培养瓶中继续接种培养。重复以上步骤， 逐渐提高ADM药物浓度至1 μmol/L浓度， 细胞仍能稳定良好生长即肝癌耐药Bel-7402/ADM造模成功。将正常Bel-7402设为对照组， Bel-7402/ADM设为耐药组。

1. 3 观察指标 采用免疫印迹（Western Blot， WB）检测P-gp表达水平， 取正常人肝癌Bel-7402及Bel-7402/ADM细胞， FBS清洗3次， 加入细胞裂解液， 离心15 min， 取上清液加入蛋白样缓冲液混匀， 置入100℃沸水变性5 min后-20℃保存备用。将凝胶置于电泳槽， 加甘氨酸电泳缓冲液， 取总蛋白上样， 80 V电泳， 内参照为β-actin， 蓝色蛋白样缓冲液与上下分离线>3 cm时停止电泳， 取出凝胶去除膜与凝胶气泡， 两侧放上滤纸， 置入转膜液槽， 80 V电压4℃过夜。BTBS洗膜3次， 加入二抗温育1 h， TBS洗膜3次， 加入增强化学发光（ECL）在Bio-RAD上成像并分析密度。

1. 4 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

哇巴因干预前， 耐药组P-gp表达水平为（72.68±0.07）， 对照组为（22.21±0.04）;哇巴因干预后， 耐药组P-gp表达水平为（20.61±0.04）， 对照组为（14.32±0.05）;哇巴因干预后， 两组P-gp水平均显著低于哇巴因干预前， 差异有统计学意义（P<0.05）;哇巴因干预前后耐药组P-gp水平均显著高于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。耐药组P-gp表达凝胶蛋白电泳图见图1。

3 讨论

我国作为肝癌大国[5]， 每年新发肝癌病例约占全球的50%， 且发病率逐年增长。肝癌起病隐匿， 初期多在肝病隨访或体检中偶然发现， 患者无症状， 体格检查也缺乏肿瘤指征， 出现症状就医时多进入中晚期， 大部分失去根治性手术机会， 而化疗是此阶段患者最有效治疗方式， 但肝癌在肿瘤死亡率中仅次于肺癌居于第二位， 最主要是因部分患者化疗无效或有效逐渐转为无效现象产生， 出现对未接触过、多种化学结果和作用机理不同的化疗药物交叉耐药， 即MDR。MDR[6]严重影响肿瘤治疗效果， 是肝癌化疗失败的主要原因， 严重威胁患者生命安全， 最先发现其和细胞膜糖蛋白增加有关， MDR由多种因素介导， 包括化疗药物造成损伤， 其中一些酶发挥作用， 使细胞自我修复能力增强， 导致细胞耐药（如蛋白激酶C）;肿瘤细胞凋亡基因难以正常介导细胞凋亡导致耐药机制（如CD95/CD95L）;微环境改变导致肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低;某些信号传导因子改变[如细胞转录因子蛋白家族（NF-κB）]及其中最主要的P-gp介导化疗药物外排。mdr-1基因位于染色体7q21-21， 经糖基化后形成170KD的P-gp， 属于一种跨膜转运蛋白， 由跨膜疏水区和ATP结合亲水区构成， 主要定位在细胞膜上。

目前国内外对肝癌MDR已有较多文献报道， 但对哇巴因药物下肝癌细胞株的P-gp表达的影响研究较少。P-gp[7]广泛分布全身多个器官及组织中， 参与药物体内转运， 肿瘤细胞长期接触化疗药物， mdr-1基因被诱导大量表达P-gp， 此时P-gp结合药物分子并利用ATP水解能量将疏水亲脂性化疗药物在尚未发挥细胞毒性时排除细胞外， 降低药物浓度， 细胞由此获得耐药性， P-gp发挥外排作用依赖ATP水解释放能量， P-gp包含2个ATP结合位点， P-gp识别并结合药物， 其中1个ATP激活水解释放能量， P-gp结构改变释放底物至细胞外， 随后第2个ATP水解P-gp恢复原状态， 其影响P-gp与药物结合、外排、强度及P-gp结构恢复。针对P-gp介导的肿瘤MDR， 可通过增加细胞内Ca2+浓度在mdr-1基因转录翻译上抑制P-gp合成及活性， 影响膜功能降低P-gp外排作用， 提高药物浓度， 解决肿瘤细胞耐药性。P-gp外排作为ATP能量依赖泵， 也可以从降低外排所需能量入手。有研究发现低浓度哇巴因能抑制肿瘤生长[8， 9]， 作为细胞膜上钠钾泵（Na+-K+-ATP ase）抑制剂， 可通过Na+-K+-ATP酶α亚基特异性可逆结合抑制血管内皮细胞生长， 降低细胞黏附性， 促进钠钾泵内吞加快酶的溶解， 减少细胞内钠钾泵含量， 抑制钠钾泵功能， 导致细胞内ATP分解减少， 降低P-gp将药物排除体外能力， K+浓度下降或哇巴因可抑制钠钾ATP酶50%以上导致Na+浓度上升， 引起细胞膜超极化， 激活Na+/Ca2+

对向转运体， Ca2+浓度上升， 影响mdr-1基因转录翻译P-gp。本研究以非耐药人肝癌Bel-7402细胞系为亲代细胞， 采用ADM诱变产生Bel-7402/ADM模型， 以WB测定哇巴因干预前后P-gp表达， 利用抗原抗体特异反应， 有效排除其他蛋白质干扰。本文研究结果显示， 哇巴因干预前， 耐药组P-gp表达水平为（72.68±0.07）， 对照组为（22.21±0.04）;哇巴因干预后， 耐药组P-gp表达水平为（20.61±0.04）， 对照组为（14.32±0.05）;哇巴因干预后， 两组P-gp水平均显著低于哇巴因干预前， 差异有统计学意义（P<0.05）;哇巴因干预前后耐药组P-gp水平均显著高于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。由此说明肿瘤细胞耐药时P-gp呈高表达状态， 哇巴因可有效降低P-gp表达， 耐药组干预后可恢复至对照组未受干预状态， 增加肿瘤细胞对ADM敏感性， 实现逆转耐药作用。

综上所述， 哇巴因可有效下调肝癌细胞株的P-gp表达。

参考文献

[1] 中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局. 原发性肝癌诊疗规范（2017年版）. 中华消化外科杂志， 2017， 16（7）：635-647.

[2] 李慧， 路潜， 杨萍， 等. 原发性肝癌手术患者症状及延续照顾需求的研究. 中华护理杂志， 2015， 50（6）：684-688.

[3] 祝普利， 尹超， 冯建龙. 原发性肝癌综合治疗进展. 临床肝胆病杂志， 2015， 31（6）：965-968.

[4] Raderer M， Scheithauer W. Clinical trials of agents that reverse multidrug resistance. A literature review. Cancer， 1993， 72（12）：

3553-3563.

[5] Gao J， Xie L， Chen WQ， et al. Rural-urban， sex variations， and time trend of primary liver cancer incidence in China， 1988-2005. European Journal of Cancer Prevention， 2013， 22（5）：448-454.

[6] 楊超， 俸婷婷， 刘雄利， 等. 细菌多重耐药机制及其检测方法研究新进展. 中国病原生物学杂志， 2015（11）：1047-1050.

[7] Alfarouk KO， Stock CM， Taylor S， et al. Resistance to cancer chemotherapy： failure in drug response from ADME to P-gp. Cancer Cell International， 2015， 15（1）：71.

[8] 李杰， 徐忠伟， 程世翔， 等. 哇巴因诱发人神经胶质瘤U251细胞凋亡的机制. 武警后勤学院学报（医学版）， 2016（3）：174-177.

[9] Baker RM， Brunette DM， Mankovitz R， et al. Ouabain-resistant mutants of mouse and hamster cells in culture. Cell， 2015， 1（1）：9-21.