合成生物学在肿瘤治疗方面的应用和前景

丁杰　杨旭娟　段虹宇　张安琪　张博雅　鲁佳敏　符庆刚　李博玮　刘曜珲

【摘要】 合成生物学运用工程学和生物学方法工程化的合成生物系统、连接遗传线路，最终获得人们所需要的生物功能。目前合成生物学在能源、材料、健康等方面均已经得到了很大的应用。合成生物学在肿瘤治疗领域的关注度也不断升温，在药物的递送、免疫学系统攻击肿瘤、工程设计非免疫细胞杀伤肿瘤细胞、转录和转录后水平抑制肿瘤、揭示肿瘤迁移机制研究以及检测转移瘤等方面取得了一些突破性的进展。将合成生物学方法运用到肿瘤治疗中已成为肿瘤治疗的一个新的方向。本文介绍了合成生物学的概念及发展状况，探讨合成生物学在肿瘤治疗方面的应用和前景。

【关键词】 合成生物学; 肿瘤; 治疗

Application and Prospect of Synthetic Biology in Tumor Therapy/DING Jie，YANG Xujuan，DUAN Hongyu，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：-172

【Abstract】 Synthetic biology uses engineering and biological methods to engineer the synthesis of biological systems and the connection of genetic circuits，and finally obtains the biological functions that people need.At present，synthetic biology has been widely used in energy，materials，health and so on.Synthetic biology is also getting more and more attention in the field of tumor therapy.Some breakthroughs have been made in drug delivery，immunological system attacks on tumors，engineering design of non-immune cells killing tumor cells，transcriptional and post-transcriptional inhibition of tumors，research on the mechanism of tumor migration，detection of metastatic tumors，and so on.The application of synthetic biological methods in tumor treatment has become a new direction of tumor treatment.In this paper，the concept and development of synthetic biology were introduced，and the application and prospect of synthetic biology in tumor therapy were discussed.

【Key words】 Synthetic biology; Tumor; Treatment

First-authors address：Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.044

肿瘤严重影响人类健康，但其传统治疗方法的发展已进入瓶颈阶段，近些年合成生物学在肿瘤的精确高效治疗、肿瘤迁移机制的研究等方面得到了很大的应用。合成生物学作为一门新兴学科在肿瘤治疗方面有很大的应用前景，与此同时一些问题也有待解决。

1 合成生物学的概念及发展状况

合成生物学是工程与生物学相结合的一个新兴的、发展迅速的领域。它的目的是为特定目的设计新的或重新设计现有的生物系统。早些年，简单的设备和部件（如开关和振荡器）的设计已经开始;随着近年来成功设计的设备被用于创建越来越复杂的系统，合成生物学正进入一个新的发展阶段[1]。在能源、材料、医药健康、生命科学等多领域形成许多开创性的技术[2]。

2 合成生物学在肿瘤治疗方面的应用

2.1 利用细菌活体递送药物 利用细菌对抗癌症的想法早在1891年由McCarthy[3]提出：链球菌感染患者，激活免疫系统来治疗癌症。基于当时无法确定链球菌感染的毒性等问题，该方法饱受争议。随着人们逐渐对肿瘤微环境和微生物了解的深入，以及基因工程技术的成熟，不断有研究者重拾该思路。Din等[4]利用合成生物学在鼠伤寒沙门氏菌内构建了基因回路，使细菌群体在肿瘤组织中同步周期性合成與释放抗肿瘤药物。该项设计主要包括两个重要的部分。

2.1.1 限制细菌数量，动态裂解细菌 研究者们使用合成生物学构建大肠杆菌中的“群体感应”基因电路，LuxI、LuxR和酰基高丝氨酸内酯（AHL）在该回路中具有重要作用：LuxI酶催化AHL分子的合成，LuxR是AHL受体蛋白，可激活细菌群体感应转录效应[5]。当细菌种群密度低，LuxR表达水平较低，合成的AHL分子不会在细胞积聚，迅速扩散到胞外。当细菌密度增加时，由于胞内外AHL浓度梯度高。一旦胞内AHL浓度达到一定阈值，AHL分子与LuxR结合。反过来，LuxR激活PluxI启动子，从而启动靶基因的表达。值得注意的是，AHL可以穿过细胞膜扩散，所以群体细菌中的AHL浓度基本相同，确保了细菌群体中基因表达程序的同步执行。

Din等[4]将该基于AHL的群体效应作为一种工具使改造的鼠伤寒细菌实现同步化，同时设计了可以引起细菌溶解的“自杀”系统——源自细菌病毒φX174的裂解蛋白E。在鼠伤寒细菌大规模自杀之后，还会残存一些细菌，进入了下一个细菌种群动态循环。

2.1.2 正确有效的联合药物 有学者测试了3种可以使肿瘤缩小的蛋白质治疗剂[4-5]。他们在鼠伤寒杆菌中植入可以生成这些蛋白质药物的基因，实验结果表明可以生成足够用于杀死肿瘤细胞的蛋白质药物。遗憾的是，尽管该研究采用了更为安全的动态裂解体系来控制药物的释放以及将细菌群落控制在一定的范围内，但是仍然不能根除肿瘤，需要同化疗药物联用。

除了利用细菌直接递送药物，还出现了腺苷酶前体药物治疗（BDEPT）这种新兴的癌症治疗方法。它是基因治疗的一种双相变体，在治疗的第一阶段，细菌已经装备了一个基因编码的酶，可以转换惰性前药为细胞毒性活性药物成分（API）。被注入到体内的细菌具有在肿瘤中选择性增殖的先天能力，定居到肿瘤中后开始增殖。一旦肿瘤内的细菌达到足够的数量，酶的生产将被放大。第二阶段通过给前药开始。给药后，前药系统地在全身传播，但主要在肿瘤中被局部产生的酶激活。API在恶性肿瘤中扩散开来，但是健康组织可以免受损伤，由于活性药物是在肿瘤内部局部产生的，这种方法可以被认为是一种局部化疗方法[6]。

2.2 免疫系统攻击肿瘤细胞 Nissim等[7]设计了一套病毒递送的基因表达体系。这套体系里的基因表达启动子能与癌细胞特异蛋白相结合，且只有两种启动子同时被激活后，整个基因表达体系才能运作。这套体系会产生具有免疫原性的细胞表面蛋白、细胞因子、趋化因子以及免疫检查点抑制剂抗体。在免疫系统看来，这简直就是癌细胞的投案自首，它们会毫不留情地将癌细胞消灭。在细胞和动物水平，该“基因电路”能有效地激发免疫系统发现并特异性攻击肿瘤细胞，而不杀伤正常细胞。

同时，内源性细胞也可以用作治疗剂。T细胞广泛分布于组织和肿瘤环境中，它们在细胞介导的免疫中起着中心作用，能够介导长寿命的、抗原特异性的效应器和免疫记忆反应。然而肿瘤可以利用多种策略来逃避宿主的免疫反应，包括靶抗原的下调或弱免疫原性，以及创造免疫抑制的肿瘤环境[8]。因此运用合成生物学方法将从患者体内提取的T细胞进行基因工程改造，使其重新获得对肿瘤的特异性识别能力，再将其植入患者体内治疗肿瘤，成为肿瘤治疗的一个研究热点。

近年来，通过在嵌合抗原受体（CARS）中引入抗体样识别来对T细胞进行基因修饰的策略已经取得了实质性的进展[8]。迄今为止，CAR T细胞在根除血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大的成功[9]。尤其是CD19 CARS在急、慢性B细胞白血病中[10-11]以及在淋巴瘤[12-13]和骨髓瘤患者中的应用[14-18]。同时，越来越多的临床试验将CAR T疗法聚焦于实体肿瘤，但是实体瘤的实验结果并不乐观，因为CAR T细胞向实体瘤的转化一直存在着许多障碍，包括安全性、T细胞的持续和扩增、T细胞向肿瘤的转移，以及在肿瘤内建立的免疫耐受机制，这些机制可能决定CAR T细胞的最终命运。由于其独特的微环境和解剖位置，这些障碍中有许多是实体肿瘤所特有的[19]。但也有复发性多灶性胶质母细胞瘤患者接受了针对肿瘤相关抗原白细胞介素13受体α2（IL13Rα2）的CAR T后所有颅内和脊柱肿瘤均有消退，同时脑脊液中细胞因子和免疫细胞水平也相应升高的案例[20]。此外也有将CAR T技术运用到乳腺癌、HER2阳性肉瘤、胰腺癌转移瘤的治疗研究的报道[21-23]。具体地说，利用CAR构建的T细胞是迄今为止最有前途的基于细胞的治疗方法。

可是虽然CAR T细胞的研究很有应用前景，但是这种方法由于肿瘤特异性单一抗原的稀缺性而受到限制。而且靶向抗原也往往存在于癌旁组织中，可能会引起危及生命的不良反应。一种增强治疗性T细胞靶上活性的有效方法是对其进行工程设计，使其需要组合抗原才能被激活。Roybal等[24]设计了一个组合激活的T细胞电路，其中一个抗原的合成Notch受体诱导另一个抗原的CAR的表达。这些双受体和门T细胞只有在双重抗原肿瘤细胞存在的情况下才能被武装和激活。这些T细胞在体内显示出精确的治疗识别-保留单个抗原的“旁观者”肿瘤，同时有效地清除组合抗原“疾病”肿瘤。这种精密的双受体电路为更广泛的肿瘤免疫识别打开了大门。

2.3 工程设计非免疫细胞杀伤肿瘤细胞 除了对免疫细胞的基因工程设计，也有人尝试在非免疫细胞中开发T细胞受体样信号转导装置来靶向杀伤肿瘤。Kojima等[25]在一种来自人胚胎肾细胞的常见细胞系：HEK-293T细胞，和人间充质干细胞中构建了癌症检测传感器。该传感器分为两部分：一部分从细胞膜中伸出，像天线一样，抑制内源性信号途径;另一部分由两个受体组成，当它们感应到癌细胞表面的特殊蛋白时，就能激活上述的信号途径。进而引发了一系列反应，导致一些内源性和Kojima等[25]设计的细胞系发生变化，最终造成一种药物活化酶的释放。这种酶再被运到邻近的细胞，将前药（prodrug）转化为活性形式，杀死肿瘤细胞及部分肿瘤细胞周围的正常细胞。配备这种细胞接触传感装置的设计细胞有望在避免与工程免疫细胞相关的风险的同时，用于基于细胞的癌症治疗。

2.4 转录和转录后水平抑制肿瘤 癌基因转录因子和微小RNA分别作为转录和转录后调节因子在人类肿瘤中发挥重要作用。因此有学者利用合成生物学方法调控癌基因转录因子以及微小RNA从而在轉录和转录后水平抑制肿瘤，这为肿瘤治疗提供了新的思路[26]。

Xie等[26]设计了一种人工长链非编码RNA，通过在转录水平和转录后水平同时调节致癌信号通路来抑制膀胱癌的恶性表型。这个工具包含两个模块，编码在质粒上。第一个模块是RNA适体，能够捕获包括转录因子（TFs）在内的蛋白质。第二个模块是microRNA海绵，它通过与目的miRNAs的部分互补结合，导致miRNAs失去功能。基于此原理，他们将β-catenin适配子的两个串联cDNA序列与miR-183-96-182簇的6个结合位点的cDNA串联拷贝（该簇的miRNA每个拷贝两份）结合起来构建了一个人工长链非编码RNA。通过采用双荧光素酶报告分析、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及相关表型实验，检测相关基因的表达及该装置的热效应，结果表明该装置具有抗肿瘤的作用。

2.5 揭示肿瘤细胞迁移机制、检测肿瘤转移 转移是绝大多数癌症相关死亡的罪魁祸首[27]。转移性肿瘤不仅由于其在不同器官中的解剖彌散分布而难以用常规手术或放疗治疗，而且在大多数情况下对细胞毒药物也是耐药的。尽管20世纪在影像学和肿瘤细胞鉴定方面的一些技术进步极大地提高了对肿瘤转移的认识，但肿瘤转移和耐药的分子机制尚不清楚导致在200多种已被批准用于临床治疗的抗癌药物中，没有一种能特异性和有效地抑制肿瘤转移[28]。因此利用合成生物学的方法研究肿瘤细胞的迁移机制有望为肿瘤细胞的迁移扩散提供理想的治疗靶点。

大量的研究表明COL1A1在大肠癌组织和配对淋巴结组织中表达上调，Zhang等[29]利用脂质转染法将设计的一段siRNA转染大肠癌细胞，该siRNA的核酸序列能大肠癌细胞COL1A1的表达。Transwell实验表明，COL1A1能促进大肠癌细胞的体外迁移。同时还发现，COL1A1与WNT/平面细胞极性（PCP）信号通路相关，抑制COL1A1可降低RAS相关的C3肉毒杆菌毒素底物1-GTP、磷酸化c-jun氨基末端激酶和RhoA-GTP的表达，这些基因都是WNT/PCP信号通路中的关键基因。因此COL1A1可能通过WNT/PCP通路促进大肠癌细胞的迁移。他们的结果表明COL1A1能促进肿瘤转移，其抑制可能抑制CRC细胞的迁移。另外，COL1A1在大肠癌转移中的作用可能与WNT/PCP通路的调节有关。因此COL1A1可能是一个很有前途的治疗CRC的靶点。

Yagi等[30]利用多种实验方法，包括合成生物学方法，表明信号选择性抑CXCR4-Gα13-Rho轴可防止基底样乳腺癌细胞的转移扩散。他们先用一种合成生物学方法重构乳腺癌细胞中G蛋白调节的网络，稳定表达了一个突变GαI偶联的GIRASSL，通过实验来证明GαI的激活可能不足以促进转移性乳腺癌细胞的迁移。之后又设计了一个可被人工配体激活的Gα13i5，这是Gα13的一种嵌合形式，其中C-末端5个氨基酸被GαI的氨基酸取代，使其能够与GIRASSL偶联并被GIRASSL激活，最终的实验结果表明Gα13在乳腺癌细胞运动和跨血管细胞迁移中具有关键作用。

同时，绝大多数转移瘤的发现都是在转移的较晚阶段，这也使很多肿瘤患者难以得到根治。因此，需要设计一些高灵敏的工具来检测现有诊断工具所不能企及的小转移。这将使患者获得最佳的治疗时机。

Danino等[31]设计了PROP-Z益生菌用于非侵袭性癌症检测。PROP-Z诊断平台由转化有双稳定、高表达LacZ载体的益生菌ECN细菌和一个基因集成的CDABE盒组成，该盒可在不提供外源荧光素（蓝色）的情况下实现发光可视化。其机制为患者口服PROP-Z后，该益生菌在胃肠道内迅速迁移（24 h内），通过肝门静脉直接从肠道流出到肝脏，从而导致肝脏肿瘤的优先定植并在肝转移瘤中特异性扩增。PROP-Z可以表达高水平的LacZ酶，使注入的可切割底物消失。底物过滤器的裂解产物通过肾系统，进入尿液后可以被检测出来。

3 研究前景与展望

合成生物学手段在肿瘤治疗方面的应用解决了传统肿瘤治疗手段的很多问题，比如靶向药物/酶的递送在很大程度上减轻了传统化疗手段所难以避免的对大量健康组织的损伤，这一类似局部化疗的手段将使临床治疗更精确、更敏感。又比如结合合成生物学手段揭示肿瘤的迁移机制，将更有利于对肿瘤转移的阻碍与治疗，而这对传统外科手段来说几乎是无能为力的。此外，激活自身免疫系统对肿瘤细胞的杀伤，也为肿瘤治疗开启的新的大门。

但是也有很多有待解决的问题，比如动物实验与临床实验之间的宿主差异要求制定和加强研发实践，以弥合临床和临床前观察之间的差距。还需要开发和改造更多更优的肿瘤特异性生物传感器（比如各种光控传感器，基于肿瘤微环境的传感器：如基于代谢产物尿酸、乳酸的传感器）;改造与筛选出具有特定功能的细菌和/或细胞（如改造肠道中的益生菌或人体自身的细胞——甚至干细胞和癌细胞为载体;改造特异性定殖在器官中的细菌，即改造引起该部位疾病的细菌以治病），提高质粒稳定性（防止基因突变），设计与筛选出更多更有效的抗癌药物（如研发适合的细菌中合成与表达的抗肿瘤的多肽药物和毒性肽），也可以联合免疫疗法与抗癌药物试验;虽然已有抗肿瘤药物应用到临床，但是肿瘤仍然是全人类面临的重大挑战。由于人体构造与代谢的复杂性，现有药物受到“离子障”“首关效应”等的制约，其生物利用度不高。据报道，纳米制剂治疗肿瘤时，其平均生物利用度也仅有0.7%。合成生物学是一门新兴的学科，尽管研究还不是很成熟，体内实验安全性问题还未解决，但其在肿瘤治疗方面有非常广阔的应用前景。

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