利用透性化黑曲霉细胞制备稀有人参皂苷Rh1的方法研究

耿瑜， 蒋明星， 熊正红， 文孟良*

( 1.云南大学 生命科学学院， 云南 昆明 650500； 2.昆明学院 农学与生命科学学院， 云南 昆明 650214 )

0 引言

三七人参皂苷是三七的主要药效成分之一，包括Rb1、Rb2、Rg1、R1等常量人参皂苷组分[1-2].研究表明，常量人参皂苷在人体内代谢后，其产生的稀有人参皂苷在抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及提高免疫方面具有显著的疗效[3-7].目前，稀有人参皂苷Rh1主要是通过合成和转化的方法来获取[8]，其中微生物转化法具有反应体系稳定、菌种生长迅速、转化周期短且无需分离纯化酶液等优点，受到众多研究者的青睐[9].目前，我国利用微生物转化反应生产稀有人参皂苷的研究仍处于初期阶段[3]，相关研究多集中于把分离纯化得到的单一常量人参皂苷转化为另一种稀有人参皂苷.例如,利用Mucilaginibacter sp.(鞘氨醇单胞菌)和Microbacterium esteraromaticum(酯香微杆菌)的β -glucosidase重组酶将Re、Rg1转化为Rg2和Rh1[10-11]；利用Aspergillus niger(黑曲霉菌)中的β -glucosidase将Rf转化为Rh1[12].本文以三七的三醇组常量人参皂苷(含Re、Rg1、R1)为底物，以透性化处理的黑曲霉细胞为转化菌株，以此探索获取稀有人参皂苷Rh1的微生物转化法.

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂和培养基

黑曲霉菌，由实验室分离并保存.Span-20，生工生物工程上海股份有限公司；四氯化碳、吐温-60、吐温- 80，天津风船化学试剂科技有限公司；EDTA，BioFRoxx；戊二醛，天津盛奥化学试剂有限公司；乙醇，广东光华科技股份有限公司；液氮，普诺斯商贸有限公司；三醇组人参皂苷(含Re、Rg1、R1，其中Rg1含量大于50%，Re和R1含量小于10%)，云南西草生物科技有限公司；Rh1标样，云南与诺生物工程有限责任公司；硅胶板，青岛海洋化工厂分厂.PDB黑曲霉菌丝体培养基(1 L)：20 g葡萄糖，200 g马铃薯，自然pH.PDA黑曲霉孢子培养基(1 L)： 20 g葡萄糖，20 g琼脂，200 g马铃薯，自然pH.液体诱导培养基(1 L)： 1 g酵母粉，1 g胰蛋白胨，2 g三醇组人参皂苷(Rg1含量大于50%、Re和R1含量小于10%)，自然pH.

1.2 仪器

电子天平，Denver Instrument TP-214；恒温培养振荡器，Eppendorf Thermonixer；恒温水浴锅，北京长风仪器仪表公司；离心机，Eppendorf Centrifuge 5418；超声破碎仪，Kudos Ultrasonic；摇床，Shiping Rocking Incubator；旋转蒸发仪，EYELA OSB -2100；高效液相色谱仪，Agilent 1100.

1.3 实验方法

1.3.1种子液的制备与诱导培养 在三角瓶(250 mL)中加入50 mL PDB培养基，接种黑曲霉孢子，在28 ℃、180 r·min-1条件下摇床培养2 d，制得黑曲霉菌丝体，作为种子液待用.在三角瓶(250 mL)中加入50 mL液体诱导培养基，接种10%的种子液，在30 ℃、180 r·min-1条件下摇床培养4 d后，转至室温静置培养7 d直至在培养基中能够检测到有稀有人参皂苷Rh1产生.

1.3.2透性化细胞的制备 1)化学法.将湿重1 g 的黑曲霉细胞置于2 mL离心管中,然后加入表1中的透性化试剂1 mL.在28 ℃、50 r·min-1条件下振荡处理30 min，离心5 min (12 000 r·min-1)，以去除透性化试剂.用0.2 mol·L-1磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1磷酸二氢钠+0.2 mol·L-1磷酸氢二钠，pH=8.0)洗涤沉淀细胞，离心5 min (12 000 r·min-1)，最终收集的菌体即为通透性细胞.

2)物理法.冻融处理：将湿重1 g的黑曲霉细胞置于2 mL离心管中，使用冻融(液氮速冻、45 ℃水浴溶解)的方法处理细胞，离心5 min (12 000 r·min-1)后收集得到的菌体即为通透性细胞.超声处理：用磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1磷酸二氢钠+0.2 mol·L-1磷酸氢二钠，pH=8.0)洗涤诱导培养的细胞，离心5 min (12 000 r·min-1)后将沉淀超声处理(53 kHz) 15 min即得通透性细胞.

表1 不同方法选用的试剂及其用量

3)联合法.将湿重1 g的黑曲霉细胞置于2 mL离心管中，分别使用冻融(液氮速冻+45 ℃水浴溶解)+超声的方法、冻融+化学的方法、冻融+超声+化学的方法、超声+化学的方法处理细胞，然后离心5 min (12 000 r·min-1)去除透性化试剂.用磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1磷酸二氢钠+0.2 mol·L-1磷酸氢二钠，pH=8.0)洗涤细胞后再离心5 min (12 000 r·min-1)即得通透性细胞.

1.3.3产物检测 将上述方法得到的透性化细胞与1 mL 0.2%(质量分数)的三醇组皂苷溶液水浴反应30 min (45 ℃).用等体积正丁醇萃取溶液，然后取正丁醇层溶液进行薄层层析，展开剂为氯仿-甲醇(体积比为85∶15)，显色剂为甲醇-硫酸-乙酸(体积比为85∶5∶10).蒸干每组实验产量最高的正丁醇层(0.9 mL)，将得到的粉末状样品溶于5 mL甲醇中，过滤后取10 μL进行高效液相色谱(HPLC)检测.色谱柱为Lichrospher C18色谱柱，柱温为30 ℃，紫外检测波长为203 nm，进样量为10 μL，流动相为水(A)和乙腈(B).流动相洗脱梯度： 0～52 min， 69%(A)+31%(B)； 52～53 min， 35%(A)+65%(B)； 53～69 min， 100%(B)； 69～76 min， 69%(A)+31%(B)(百分数均为体积分数).

2 结果与分析

2.1 不同试剂透性化处理黑曲霉细胞对Rh1产量的影响

利用不同试剂对黑曲霉细胞进行透性化处理后，使用磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1磷酸二氢钠+0.2 mol·L-1磷酸氢二钠，pH=8.0)洗涤通透性细胞，然后将其与0.2%(质量分数)的三醇组人参皂苷溶液反应30 min (45 ℃)，结果如图1所示.对照组细胞用1 mL无菌水代替透性化试剂进行处理.

由图1可知，不同的透性化试剂对细胞产生的影响不同.四氯化碳组、四氯化碳+乙醇组的Rh1转化率低于对照组，其原因可能是四氯化碳、四氯化碳+乙醇抑制了生物的修复功能[16]，进而导致细胞死亡和蛋白变性； 45% span-20组、span-20+EDTA组、span-20+乙醇组的Rh1转化率与对照组接近，这可能是45% span-20、span-20+EDTA、span-20+乙醇组未能损伤细胞膜表面蛋白，因而无法提升黑曲霉细胞的通透性作用；甲苯组、戊二醛组、乙醇组、吐温- 60组、吐温- 80组、EDTA组的Rh1转化率均得到提高，其中EDTA组的转化率最好.甲苯组、戊二醛组和乙醇组能够提高Rh1转化率的可能原因是，这3种试剂对微生物细胞具有微毒性，能部分损伤黑曲霉的细胞壁及细胞膜，进而能够促进细胞通透性的提高[17].吐温-60组和吐温-80组能够提高Rh1转化率的可能原因是，去垢剂促使细胞膜自溶，从而提高了细胞通透性[14].螯合剂能够提高Rh1转化率的可能原因是，EDTA螯合细胞膜表面的阳离子后，失去阳离子的失活膜蛋白破坏了细胞膜的完整性，进而提高了细胞的通透性[18].

1为Rh1标样； 2为对照组； 3为2%甲苯； 4为2%戊二醛； 5为2% CCl4； 6为1% CCl4+2.25% EDTA； 7为1% CCl4+5%乙醇； 8为45% span-20； 9为22.5% span-20+2.25% EDTA； 10为22.5% span-20+5%乙醇； 11为0.4%吐温- 60； 12为0.4%吐温- 80； 13为4.5% EDTA； 14为10%乙醇图1 不同试剂透性化处理黑曲霉细胞对Rh1产量的影响

2.2 不同质量分数的EDTA对Rh1产量的影响

分别选择质量分数为1%、2%、3%、4.5%、5%和6%的EDTA透性化处理黑曲霉细胞，结果如图2所示.由图2可以看出，用不同质量分数的EDTA透性化处理细胞时，其Rh1的产量不同；当EDTA质量分数为3%时，其Rh1的产量最佳.

1为Rh1标样； 2为对照组； 3为1% EDTA； 4为2% EDTA； 5为3% EDTA； 6为4.5% EDTA； 7为5% EDTA； 8为6% EDTA图2 不同质量分类的EDTA对Rh1产量的影响

2.3 不同透性化处理时间对Rh1产量的影响

以3% EDTA为透性化试剂时，不同透性化处理时间对细胞通透性的影响，如图3所示.由图3可以看出，当处理时间超过30 min时，Rh1的产量不再明显增加.这表明，透性化处理30 min即可达到较好的渗透效果.

1为Rh1标样； 2为对照组； 3为3% EDTA处理15 min； 4为3% EDTA处理30 min； 5为3% EDTA处理45 min； 6为3% EDTA处理60 min； 7为3% EDTA处理75 min； 8为3% EDTA处理90 min图3 不同透性化处理时间对Rh1产量的影响

2.4 不同透性化处理方法对Rh1产量的影响

分别采用物理法(冻融的方法、超声的方法)、化学法(3% EDTA)、物理和化学联合法(冻融+超声的方法、冻融+化学的方法、超声+化学的方法、冻融+超声+化学的方法)[13]透性化处理黑曲霉细胞，结果如图4所示.超声与3% EDTA联用的方法获得通透性细胞的效果最好，其原因可能是超声处理对细胞损伤适宜，既能提高通透性，又可避免因改变外界环境而对胞内复合酶系造成的伤害，即促进了胞内复合酶系与底物的结合反应；冻融法、化学法、冻融+超声的方法、冻融+化学的方法以及冻融+超声+化学的方法对Rh1的产量影响不大，均与对照组相似，这可能是冻融的过程能够引起蛋白交联，从而导致蛋白变性[19].

1为Rh1标样； 2为对照组； 3为冻融法； 4为超声法； 5为3% EDTA法； 6为冻融+超声的方法； 7为冻融+3% EDTA的方法； 8为超声+3% EDTA的方法； 9为冻融+超声+3% EDTA的方法图4 不同透性化处理方法对Rh1产量的影响

2.5 产物的HPLC检测

取待测样品(2.1中4.5% EDTA样品、2.2中3% EDTA样品、2.3中30 min样品、2.4中超声+3% EDTA样品)的正丁醇层溶液0.9 mL，蒸干后溶解于5 mL甲醇中(稀释5.56倍).各取10 μL待测样品进行HPLC检测，结果如图5所示.采用单点校准法[20]对得到的峰面积数据,按照公式Ci=Cs×Si/Ss计算Rh1的浓度值，结果如表2所示.上式中Ci和Cs分别为待测溶液和标准溶液中Rh1组份的浓度(mg·mL-1)，Si和Ss分别为待测溶液和标准溶液中Rh1组份的峰面积(mAU). 由图5 B —图5 E可知， 4种样品的出峰保留时间(25.150、25.242、25.008、25.287 min)与Rh1标样(图5 A,25.310 min)基本一致，这表明透性化处理黑曲霉细胞的转化反应中有Rh1生成.由表2可知，超声+3% EDTA联用方法的通透性效果最好.

表2 单点矫正法测得的样品浓度

A为Rh1标样； B为不同试剂透性化处理黑曲霉细胞的13号样品(4.5% EDTA)； C为不同质量分数的EDTA透性化处理黑曲霉细胞的5号样品(3% EDTA)； D为不同透性化处理时间处理黑曲霉细胞的4号样品(30 min)； E为不同透性化处理方法处理黑曲霉细胞的8号样品(超声+3% EDTA)图5 产物的HPLC检测图

3 结论

本文使用不同透性化试剂、不同质量分数的试剂、不同透性化处理时间以及不同的透性化方法对黑曲霉细胞进行透性化处理以制备稀有人参皂苷Rh1.通过薄层层析检测和HPLC分析表明， 联合3% EDTA与超声法(53 kHz)时，Rh1的制得效果最好.这表明该方法能在保证细胞完整性的前提下，提高细胞壁和细胞膜的通透性，进而使底物能够进入细胞内与复合酶结合反应.该方法对细胞毒性小，反应条件温和，操作简单，实用性强.另外，用三七的三醇型常量人参皂苷(Re、Rg1、R1)作为转化反应的底物，可节省分离和纯化单一常量人参皂苷成分的时间和成本，因此本文方法为制备Rh1提供了新的思路.