热水浸提法提取鹿茸胶原蛋白工艺研究

高鸿蒙 王智慧 雅茹

1 试验方法

1.1 胶原蛋白的提取

取干鹿茸30g，粉碎匀浆，加入1500ml蒸馏水匀浆抽提，离心分（10000r/min，20min）。残渣用8倍NaOH溶液搅拌过夜，离心分离（10000r/min，20min），重复用碱洗三次，去除上清液，将沉淀用蒸馏水冲洗，离心（10000r/min，20min），如此反复2次。加60%乙醇1000mL，4℃浸提48h，纱布过滤，离心，上清液于50℃、60r/min旋转蒸发回收乙醇，提取液置于截流分子量范围8～15kDa的透析袋中，对蒸馏水透析24h，-20℃预冻24h，冻干，即得鹿茸胶原。

1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用DYCZ-24D型垂直板凝胶电泳槽，采用浓度为10%的分离胶和浓度为5%的浓缩胶，浓缩胶电压为70mV，分离胶电压140mV。采用考马斯亮蓝R250进行染色，最后用脱色液（甲醇∶冰醋酸∶蒸馏水=4.5∶4.5∶1）脱色，至背景清晰，观测分子量范围。电泳各储液放入0～2 ℃的冰箱中，隨取随用;电泳缓冲液pH值为8.3。采用的标准蛋白为：兔磷酸化酶B（97400）;牛血清白蛋白（66200）;兔肌动蛋白（43000）;牛碳酸酐酶（31000）;胰蛋白酶抑制剂（20100）;鸡蛋清溶菌酶（14400）。

配制完胶后，迅速沿着电泳槽的玻璃板边缘将胶倒入电泳槽，先到分离胶，至胶液面离玻璃板凹槽3.5厘米左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高的水，垂直放置20～30分钟左右使之凝聚。然后吸出胶面上的水，倒入浓缩胶，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐，然后插入梳子，室温放置使其凝固。待凝胶完全凝后，取下梳子，拆掉胶条，重新安装好电泳槽后，倒入电极缓冲液。检查板是否漏液，若不漏则可点样了。

点样：将样品液与加样缓冲液等体积混合后，即可用微量注射器在孔中点样。每孔上样量为20μL。加样完毕后，打开电源（负极接上槽，正极接下槽），电流初为15mA，当前沿指示剂进入分离胶后调节电流为20mA。待指示剂迁移至距下口约1cm时，关闭电源。整个电泳所需时间约为6h。

1.3 紫外分析

对提取的胶原溶液用紫外可见分光光度计测量其吸收光谱。实验中应选用石英比色皿，分光光度计的波长选在200一500nm之间。

1.4 氨基酸分析

取上述胶原冻干品约25mg，2mL6mol/LHCl水解24h，蒸干，采用1100系列高效液相进行氨基酸含量测定。衍生试剂：2，4-二硝基氟苯（FDNB）;流动相A：乙腈∶水（55∶45）;流动相B：KH2PO4，PH=7.2;梯度洗脱，流速1mL/min，进样量10μL。

在20 种常见氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高，其中甘氨酸含量几乎占了1/3，为33.24% ，脯氨酸和丙氨酸含量分别为11.64% 和11.78% ;组氨酸和酪氨酸含量较低，没有检测出胱氨酸;非常见氨基酸———羟脯氨酸的含量也非常高，为11.20% 。另外，羟脯氨酸和脯氨酸比值为0.8，和Ⅰ型胶原（0.7～0.8）一致。

2 结果分析

2.1 电泳结果分析

1.对提取的胶原蛋白进行不同倍数的稀释，稀释倍数为3倍，5倍，10倍。

电泳图片如下：见图一.

说明：图片中所显示的，第一条带为标准蛋白maker，2-4条带为稀释3倍的胶原蛋白样品，5-7条带为稀释5倍的胶原蛋白样品，8-10条带为稀释10倍的胶原蛋白样品，电泳图片表明稀释5倍的条带比较清晰。图片显示蛋白分子量为116kDa左右，符合相关文献的报道，提取的胶原为Ⅱ型胶原蛋白。

2.2 紫外分析结果

通过在200—500nm的波长下对稀释不同倍数的样品进行扫描，获得了较好的效果，最大吸收波长均在230nm，与文献报道的Ⅰ型胶原蛋白的最大吸收波长一致。结果见图四

3 结论

（1）鹿茸为原料提取胶原蛋白，方法简便易行，从对其冷藏条件下为冻状可以鉴定出所提取的物质为胶原。

（2）从电泳的结果看，所提取的物质为胶原的水解产物，胶原蛋白或者是明胶，因为胶原的分子量为300kDa，但其水解后的产物胶原蛋白的分子量为十万左右，符合文献的报道。

（3）从紫外分析的结果看，所提取的物质中含有Ⅰ型胶原蛋白。

基金项目：锡林郭勒职业学院研究课题（编号：QN-2019-02）。

（作者单位：锡林郭勒职业学院）