可食牡丹鲜花酶法制汁及主成分HPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定

向进乐，赵胜娟，马丽苹，金文刚，费鹏，樊金玲，朱文学*

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳,471023) 2(陕西理工大学 生工学院，陕西 汉中,723001) 3(河南省食品原料工程技术研究中心，河南 洛阳,471023)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)为毛茛科芍药属木本植物，有“花中之王”的美誉，分布于我国大部分地区，在洛阳、菏泽、彭州等地有大量种植[1]。除作为重要的观赏植物，牡丹花还有很高的食用价值[2-3]。研究人员通过大鼠亚慢性毒性试验[4]和小鼠急性毒性试验[5]证实了牡丹花的食用安全性。“凤丹”牡丹花于2013年经国家卫计委批准，正式成为新食品原料[6]，也是目前唯一被批准的花朵可食的牡丹品种。可食牡丹花营养素丰富，包括糖分、有机酸、维生素和矿物质等，还含有酚酸、没食子单宁、黄酮、多糖等多种生物活性成分[2,5,7-9]。牡丹花营养和保健食品的开发是延伸牡丹产业链的重要途经之一，已报道的牡丹花食品包括牡丹花茶、牡丹鲜花饼、牡丹花酸奶、牡丹花营养酒、牡丹花饮料、牡丹花脯等[7,10]。

牡丹花的色系、品种繁多，较常作为药用，其药用成分的分析与鉴定的报道较多，鉴定的主要小分子活性成分有四类：(1)没食子酸及其衍生物，包括没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酰葡萄糖苷、没食子单宁等[9,11-13]；(2)黄酮糖苷类，包括槲皮素糖苷、山奈酚糖苷、芹菜素糖苷、异鼠李亭糖苷、金圣草素糖苷等[9,13-16]；(3)花色苷类，包括矢车菊糖苷、天竺葵糖苷、芍药花青苷等[9,16-17]；(4)单萜糖苷类，包括芍药苷、乙酰芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷等[11-13]。

“凤丹”牡丹属于白色系牡丹花，不含花色素[9]，具有食用安全性[6]。闫慧娇等[18]分离鉴定了“凤丹”花瓣中的1个黄酮类化合物(kaempferol-3,7-di-O-β-D-glucopyranoside)， 2个没食子酸鞣质，分别为1-O-galloyl-β-D-glucose和1,2,3,4,6-trigalloyl-β-D-glucose。付磊[19]也报道了“凤丹”牡丹花的总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性。但目前对可食用的“凤丹”牡丹花及其鲜花汁中的主要有机酸、多酚物质以及萜类等成分的系统鉴定的研究报道较少。

本研究以“凤丹”牡丹鲜花为原料，通过酶法提高牡丹鲜花出汁率，可为牡丹花液态食品开发提供生产基料。采用高效液相色谱与四极杆飞行时间串联质谱(high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS-MS)联用技术分析可食牡丹鲜花汁中主要化学物质，以期为可食牡丹花保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“凤丹”牡丹鲜花：采摘于河南科技大学牡丹园；果胶酶(20 U/mg)、纤维素酶(30 U/mg)、木瓜蛋白酶(50 U/mg)：上海蓝季科技发展有限公司；Folin-Ciocalteu试剂：上海荔达生物科技有限公司；没食子酸、没食子酸甲酯标准品、甲酸、色谱甲醇：Sigma公司。

1.2 仪器与设备

HWS-26恒温水浴锅、恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；台式离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；打浆机，九阳卫厨有限公司；UV-2350 型紫外分光光度计，上海优尼科； Waters 2695高效液相色谱仪(连接有二元泵、微型真空脱气机、自动进样器717 plus、柱温箱、PDA检测器、Q-TOF -MS质谱检测器)，美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 牡丹鲜花制汁工艺

工艺流程：

牡丹鲜花→清洗→蒸汽处理→加水破碎→酶解处理→榨汁→牡丹鲜花汁→离心→分析测定

技术要点：

牡丹鲜花清洗、沥干、蒸汽杀青处理1 min，冷却备用；杀青后的牡丹花按原料∶水=1∶4(质量比)，加入纯水破碎打浆；牡丹花浆加入酶制剂进行处理，然后压榨取汁。

1.3.2 牡丹鲜花浆酶解工艺

(1)酶制剂的筛选：按牡丹鲜花浆液质量分别加入0.1%(质量分数)的果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，在40 ℃水浴酶解120 min后压榨取汁，以空白(未进行酶水解)为对照，计算牡丹鲜花出汁率、测定牡丹鲜花汁总酚含量。

(2)酶制剂的配比：果胶酶∶纤维素酶∶木瓜蛋白酶按照1∶1∶1，1∶2∶1，1∶3∶1,2∶2∶1的质量比形成复合酶制剂，按总酶用量0.1%(质量分数)加入牡丹花浆液，在40 ℃水浴酶解120 min，压榨取汁，计算出汁率。

(3)酶解温度：加入0.1%(质量分数)的复合酶制剂，分别在30、40、50、60 ℃水浴酶解120 min，压榨取汁。

(4)复合酶制剂的加入量：将优化后的组合酶制剂分别加入不同量0.1%，0.15%，0.2%，0.25%(质量分数)的复合酶制剂，50 ℃水浴酶解120 min，压榨取汁。

(5)酶解时间：添加0.15%(质量分数)的复合酶制剂，50 ℃水浴酶解30，60，90，120 min，压榨取汁，计算出汁率。

1.3.3 出汁率的计算

牡丹鲜花出汁率的计算参考向进乐等[20]的方法，按照公式(1)计算：

(1)

1.3.4 总酚含量测定

牡丹鲜花汁总酚采用Folin-Ciocalteu比色法[21]测定，以没食子酸作标准曲线，线性回归方程为y=0.232 9x- 0.007 2(R2=0.996 3)。总酚含量以没食子酸计(mg/L)。

1.3.5 HPLC色谱条件

Gemini 5μm C18110A色谱柱(150 mm×4.6 mm Phenomenex，美国)。柱温35 ℃，进样量10 μL，流速0.9 mL/min，分析时间70 min，二极管阵列检测器(DAD)在210～600 nm扫描。二元梯度洗脱液：流动相A(0.1%的甲酸水溶液)，流动相B(含0.1%甲酸的色谱甲醇)，洗脱程序如表1所示。

表1 二元梯度洗脱程序[22]Table 1 Binary gradient elution program

1.3.6 质谱条件[22]

飞行时间质谱(Q-TOF-MS)采用负离子模式(ESI-)，一级质谱扫描范围100～1 500m/z，分辨率5 000。全质谱扫描条件：毛细管电压1.45 kV，锥孔电压30 V；锥孔气体(He)和去溶剂化气体(N2)流速分别设定为45 L/h，900 L/h。离子化温度120 ℃，去溶剂化温度250 ℃。二级质谱碰撞能量设定为20，30，45 V，获取MS/MS图。

1.3.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 牡丹鲜花酶处理制汁工艺优化

2.1.1 酶制剂的选择

酶处理能显著提高果蔬汁、茶汁等液态食品的出汁率、澄清度、营养和功能成分以及香气，在液态食品加工中有非常广泛的用途[23-25]。常用的酶制剂主要是果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、单宁酶以及β-葡萄糖苷酶等[23,26]。牡丹鲜花杀青后打浆，分别添加0.1%(质量分数)的果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶，40 ℃酶解120 min，压榨取汁。计算出汁率，测定牡丹鲜花汁总酚含量。不同酶制剂对牡丹花出汁率和总酚含量的影响结果如表2所示。

表2 不同酶制剂对牡丹花出汁率和总酚含量的影响Table 2 Effects of different enzymes treatment onyield and total phenol content of peony juice

注：a,b,c不同字母表示差异显著性(P<0.05)。下同。

由表2可以看出，3种酶制剂均能显著提高牡丹鲜花出汁率，而总酚浓度差异变化不显著。由于牡丹鲜花汁液产量显著增加，说明酶处理能提高牡丹花酚类物质的得率。纤维素酶处理后牡丹鲜花出汁率最高。

2.1.2 酶制剂的复配

复合酶制剂的应用往往能起到协同效果，提高出汁率和产品质量[23,25,27]。本研究从提高出汁率、减少沉淀、提高牡丹花鲜汁的稳定性，并一定程度上改善牡丹花鲜汁的风味品质等方面，研究了纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶复配制剂处理对牡丹花浆的影响。由表2可知，纤维素酶有更好的效果，故在复合酶配比时适当增大纤维素酶的比例，加酶质量为浆液质量的0.1%。

复合酶制剂不同配比对出汁率的影响如图1所示。可以看出，果胶酶∶纤维素酶∶木瓜蛋白酶(质量比)为1∶2∶1和2∶2∶1出汁率较高。果胶酶∶纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2∶1(质量比)处理后，相比于未经酶处理，牡丹鲜花出汁率能提高约20%。故本研究中以该复配比作为复合酶使用。

图1 复合酶制剂不同配比对牡丹花出汁率的影响Fig.1 Effects of formulations of compound enzyme treatment on yield of peony juice注：图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。下同。

2.1.3 复合酶处理温度

酶处理温度对酶制剂的催化活力有显著影响，不同酶制剂以及复合酶制剂的最佳催化能力不同[27]。以2.1.2中优化的果胶酶∶纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2∶1 的复合酶制剂处理牡丹鲜花浆，不同温度条件复合酶处理对出汁率的影响如图2。可以看出，30～60 ℃，相比30 ℃，较高的酶解温度能显著提高牡丹鲜花出汁率。酶解温度在50 ℃时出汁率最高，其次是40 ℃，两者无显著差异。

图2 复合酶处理温度对牡丹花出汁率的影响Fig.2 Effects of temperature of compound enzyme treatment on yield of peony juice

2.1.4 复合酶的添加量

复合酶添加量(质量分数)从0.10%提高0.25%，随着酶制剂使用量的增加，牡丹花出汁率显著升高，结果如图3，当加酶量超过0.15%后出汁率升高不明显。考虑到加工成本，选择添加复合酶制剂质量分数为0.15%。

图3 复合酶制剂添加量对牡丹花出汁率的影响Fig.3 Effects of amount of compound enzyme on yield of peony juice

2.1.5 复合酶处理时间

复合酶处理时间对牡丹花出汁率的影响如图4所示。随着酶制剂酶解时间延长，牡丹花出汁率逐渐升高，具有显著差异。但酶解时间超过90 min，延长时间出汁率提高效果不显著。考虑到生产效率，酶解时间宜选用90 min。经过复合酶处理90 min，牡丹鲜花出汁率提高22.3%。

图4 复合酶处理时间对牡丹花出汁率的影响Fig.4 Effects of hydrolysis time on yield of peony juice

2.2 牡丹鲜花汁主要成分的HPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定

牡丹花富含多酚、单萜糖苷等功效物质。牡丹鲜花汁液化学组分经高效液相色谱分离、二极管阵列检测器(DAD)扫描，总离子流图(TIC)和基峰图(BPC)如图5所示。飞行时间质谱仪在负离子模式下(TOF-MS-ESI-)扫描结果如图6所示。根据各个组分二级质谱碎片信息以及DAD光谱图，结合标准物质以及文献报道，鉴定了20个主要色谱峰，包括有机酸、酚酸、黄酮和单帖糖苷，鉴定结果如表3所示。

2.2.1 有机酸

成分1的保留时间最短，根据一级质谱[M-H]-m/z175，DAD显示在265 nm处有最大吸收，结合参考文献[28]，鉴定该成分为抗坏血酸。抗坏血酸是牡丹花中的重要水溶性维生素之一[3]，说明牡丹鲜花榨汁后Vc得到保留。成分2一级质谱[M-H]-m/z133，二级质谱碎片m/z115[M-H-H2O]-；成分3的一级质谱[M-H]-m/z191，二级质谱碎片m/z115[M-H-CO2-2×H2O]-，结合参考文献[29]可以判断成分2和3分别为苹果酸和柠檬酸。可以看出牡丹鲜花汁主要有机酸为Vc、苹果酸和柠檬酸。

表3 牡丹鲜花汁主要化学成分的质谱信息和鉴定结果Table 3 MS/MS information and identified phytochemical compounds in peony juice

注：a通过标准品鉴定，其他成分通过与文献比较质谱和光谱信息判定。

A-总离子流图；B-基峰图图5 牡丹鲜花汁化学组分的总离子流(TIC)和基峰(BP)图Fig.5 Total ion chromatography and base peak chromatography of phytochemicals in peony juice

图6 牡丹鲜花汁化学组分TOF-MS-ESI-图Fig.6 TOF-MS-ESI- chromatography of phytochemicals in peony juice

2.2.2 没食子酸衍生物

成分5的一级质谱[M-H]-m/z169，根据二级质谱信息与没食子酸标准品对照，鉴定为没食子酸。成分4的一级质谱[M-H]-m/z331；二级质谱主要碎片为[M-H]-m/z169，是母离子丢失一个己糖基(162 Da)，其紫外光谱特征与成分5基本相同，成分4鉴定为没食子酰葡萄糖[13]。成分6一级质谱[M-H]-m/z183，二级质谱主要碎片[M-H]-m/z168、m/z124，与标准品对照，鉴定为没食子酸甲酯。成分10的一级质谱[M-H]-m/z335；二级质谱主要碎片[M-H]-m/z183，是母离子丢失一个没食子酰基(152 Da)；其紫外光谱特征与没食子酸甲酯基本相同，成分10鉴定为没食子酰没食子酸甲酯。

成分11一级质谱[M-H]-m/z为939，二级质谱碎片[M-H]-m/z787、m/z769分别为母离子丢失m/z152 Da、m/z170 Da，其他碎片信息显示该成分为含多个没食子酰基的化合物，其紫外光谱特征也与没食子酸基本相同；根据文献[30]，成分11鉴定为5-O-没食子酰葡萄糖。成分12～14的一级质谱[M-H]-m/z均为1 091，二级质谱主要碎片[M-H]-m/z939，是母离子丢失m/z152 Da的结果，其他子离子碎片信息与成分11一致，根据文献[30-31]，成分 12～14鉴定为6-O-没食子酰葡萄糖异构体。从BP图(图5)可以看出，没食子单宁为牡丹鲜花汁中含量较为丰富的多酚物质。

2.2.3 黄酮糖苷

成分7一级质谱[M-H]-m/z449，二级质谱碎片[M-H]-m/z287为母离子丢失1个已糖基m/z162 Da的结果。结合其紫外光谱特征，可以判断成分7为黄酮糖苷。根据参考文献[32]，成分7鉴定为圣草酚葡萄糖苷。成分9一级质谱[M-H]-m/z609，二级质谱主要碎片[M-H]-m/z447、m/z285为母离子连续丢失2个已糖基m/z162 Da的结果。DAD扫描显示典型的黄酮紫外光谱特征，鉴定成分7为山奈酚-3, 7-O-二葡萄糖苷[13]。成分15、16、19同样具有黄酮类化合物典型的紫外光谱特征。根据质谱信息比对文献[13,15]，成分15、16、19分别鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷，山奈酚-3-O-没食子酰葡萄糖苷，山奈酚-3-O-葡萄糖苷。成分17的一级质谱[M-H]-m/z431，二级质谱碎片[M-H]-m/z268、m/z269为母离子丢失1个已糖基m/z162 Da的结果，成分17鉴定为芹菜素-7-O-葡萄糖苷[13]。成分18的一级质谱[M-H]-m/z577，二级质谱碎片[M-H]-m/z269为母离子丢失1个脱氧己糖-己糖基m/z308 Da的结果，成分18鉴定为芹菜素-7-O-新橘皮糖苷[15]。黄酮糖苷为牡丹花主要活性成分[9,15]，牡丹鲜花汁中黄酮成分以山奈酚和芹菜素的糖苷化合物为主。

2.2.4 单帖糖苷

成分8和20的一级质谱[M-H]-m/z479、m/z629，二级质谱主要碎片与文献[13]报道结果一致，鉴定为芍药苷和牡丹皮苷B。成分21色谱峰响应值也较高，可能为牡丹花中极性较弱的化合物，一级质谱[M-H]-m/z493，但本研究未能鉴定。

3 结论

可食“凤丹”牡丹鲜花经蒸汽杀青、打浆后，添加果胶酶、纤维素酶、蛋白酶法处理可以提高牡丹鲜花出汁率。由果胶酶∶纤维素酶∶木瓜蛋白酶以质量比1∶2∶1组成的复合酶制剂能显著提高牡丹鲜花出汁率，复合酶处理条件为：酶添加量0.15%(质量分数)，酶解温度50 ℃，酶解时间90 min。复合酶法制备的牡丹鲜花汁可以作为牡丹花液态食品生产基料。

高效液相色谱与四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS-MS)联用技术可用于定性分析牡丹鲜花汁中主要生物活性物质，鉴定了牡丹鲜花汁中的20个主要成分，其中3个有机酸、8个酚酸、7个黄酮、1个芍药苷以及1个牡丹皮苷。酚酸和黄酮苷是牡丹鲜花汁中主要活性成分，主要包括没食子酸、没食子酰葡萄糖、5-O-没食子酰单宁、6-O-没食子酰单宁、芹菜素7-O-葡萄糖苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷和山奈酚-3,7-O-二葡萄糖苷等。