对硫磷纳米抗体筛选及分子识别机制研究

张玉琪 张瑾如 王锋 李家冬 司睿 吕丽珊 沈玉栋 王弘 HAMMOCK Bruce D 孙远明

摘 要 ：对硫磷是一种广谱的有机磷酸酯类杀虫、杀螨剂， 毒性极强， 可对环境和人类健康造成严重危害。尽管我国已禁止使用对硫磷， 但仍存在违禁使用现象， 加强对其监测十分必要。纳米抗体是已知最小的与抗原结合的片段（15 kDa）， 来源于骆驼科动物体内重链抗体的可变区， 具有稳定性强、灵敏度高、易表达、水溶性好等特性。本研究基于噬菌体展示技术构建了抗对硫磷纳米抗体库， 其库容为2.41 × 107 cfu/mL， 经抗原抗体固相亲和筛选及噬菌体酶联免疫法（Phage ELISA）鉴定， 获得5种抗对硫磷纳米抗体VHH1、VHH6、VHH13、VHH21和VHH24。以结合能力最强的VHH1为基础， 采用同源建模和分子对接技术探讨VHH1与对硫磷分子的识别机制， 发现VHH1与对硫磷存在氢键和疏水间分子作用力， 关键氨基酸是Ser60、Lys104、Phe105、Gly106和Arg107。本研究为抗体的进化改造和半抗原的设计提供了新思路。

关键词 ：纳米抗体; 对硫磷; 噬菌体展示; 分子模拟

1 引 言

对硫磷是一种广泛使用的有机磷酸酯类农药，具有高毒性、持久性，可抑制乙酰胆碱酯酶的活性，导致体内神经递质乙酰胆碱的大量堆积，从而引起一系列的中毒反应[1]。我国从2007年开始禁止使用对硫磷，但误用、滥用和违禁使用的现象仍时有发生[2～6]。因此，对其加强监测十分必要。

检测对硫磷的免疫分析试剂主要包括传统抗体（多克隆抗体和单克隆抗体）、重组抗体片段（单链抗体（Singlechain variable fragment，scFv）和抗原结合片段（Antigenbinding fragment，Fab））和噬菌体展示多肽[7～11]。纳米抗体是来源于骆驼科动物的重链抗体的重链可变区域，是一种独特的基因工程抗体，与传统抗体相比，具有稳定性强、易表达、易于基因工程操作、灵敏度高等特性[2]。目前，采用纳米抗体检测的小分子污染物主要包括毒素类（微囊藻毒素，赭曲霉毒素，黄曲霉毒素，呕吐毒素，橘青霉素）、激素类、有机污染物及农药类（嘧菌酯，毒莠定）[3～18]。Pírezschirmer等[6]利用固相筛选获得宽谱特异性的抗微囊藻毒素（Microcystins）的纳米抗体（Variable domain of the H chain of heavychain antibodies，VHH）A2.3，建立的ELISA半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）为0.28 μg/L。 Liu等[9]以OTAKLH免疫羊驼，构建了2×107 cfu/mL的纳米抗体库，采用固相亲和筛选获得抗OTA的灵敏的VHH28，其phageELISA和免疫PCR法的IC50为0.31 ng/mL和3.7 pg/L，检测效果良好。Bever等[20]将VHH于95 ℃热击10和60 min后，纳米抗体仍具有约65%和30%的活性，而相同条件下的多克隆抗体则失去活性。纳米抗体水溶性好，不易聚集趋势，这可能是由于骨架区FR2的疏水性氨基酸替换为亲水性氨基酸（V37F或V37Y，G44E，L45R和W47G），该区域在VH通常与VL区域结合，且进化过程中非常保守[21]。

分子模拟技术为抗体与小分子识别机制的研究提供了一条途径，同時也为抗体的分子进化提供了理论依据[22]。Qiu等[23]利用同源建模和分子对接技术证实VHH 28的CDR3区Thr102与抗呕吐毒素抗体（antiDON antibody）形成氢键，起着关键的结合作用。Jiao等[24]使用分子模拟获得结合5种Cry1毒素（Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1B，Cry1C和Cry1E）的VHH A8 CDR3区的关键氨基酸，分别为第105位天冬酰胺、第106位精氨酸、第107位缬氨酸和第114位精氨酸。

目前，有关对硫磷的纳米抗体尚未见报道。本研究采用对硫磷结构类似物H1KLH抗原免疫羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，基于固相亲和筛选获得特异性识别对硫磷的纳米抗体。分析了纳米抗体的氨基酸序列特性，通过同源建模和分子对接方法，探讨纳米抗体与对硫磷分子的识别机制，为后期抗体的进化改造和半抗原的设计提供参考。

拉氏图可用于分析蛋白质骨架结构，氨基酸残基的二面角（φ， ψ）归属于拉式图的不同区域对应不同的结构，且结构稳定性也不同[31]。拉氏图的结果主要分成4个区域：红色的核心区域（Most favoured regions）[A， B， L]、黄色的额外允许区（Additional allowed regions）[a， b， l， p]、浅黄色的大致允许区（Generously allowed regions）[～a， ～b， ～l， ～p]及空白的禁阻区（Disallowed regions）。VHH1模型的拉氏图显示（电子版文后支持信息图S1A），氨基酸的二面角坐标点100%落在有利的区域（核心区域占92.5%，额外允许区占6.6%，大致允许区占0.9%）。根据拉氏图评分标准（>90%的氨基酸落在核心区域），认为VHH1的模型是合理的，此模型可用于后续研究。

ERRAT指标（电子版文后支持信息图S1B）解释了0.35 nm范围内，不同原子类型对之间形成的非键相互作用的数目（侧链），理论上，得分>85分比较好，VHH1模型得分85.97，符合要求。

用Verify3D模块（电子版文后支持信息图S1C）对模型的三维结构与任一氨基酸序列的兼容性进行评分[32]，结果表明，91.06%残基的3D1D分值≥0.2，超过合格线80%，说明模型具有较好的可靠性。