江苏省扬泰地区犬细小病毒分子流行病学调查

2019-10-12 01:23王海燕管远红徐亚亚曹明凤崔乐遥刘宗平
中国动物检疫 2019年10期
关键词:亚型基因型扬州

王海燕,谢 静,王 涛,刘 静,管远红,张 斌,徐亚亚,曹明凤,崔乐遥,刘宗平

(1. 江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;2. 扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009)

犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)能导致犬和其他食肉动物发生急性出血性肠炎、白细胞减少症、幼犬致死性心肌炎以及恶心、呕吐等[1]。该病毒属于细小病毒科、细小病毒属[2],与猫泛白细胞减少症病原(feline panleukopenia virus,FPV)密切相关。由于先发现的犬微小病毒(canine minute virus)已被称为CPV,为了与其区别就将该病毒命名为CPV-2。由于犬微小病毒多无致病性,已被列入牛犬病毒属,因此现CPV 多指犬细小病毒[2]。

CPV 是目前动物病毒中最小、最简单的一类线状单股DNA 病毒,全长约5 323 nt,无囊膜,直径约260 Å,二十面体对称。CPV 的完整核衣壳由60 个拷贝的VP1、VP2 和VP3 蛋白组装而成,其中包括5~6 拷贝的VP1 和VP3,以及53~54 拷贝的VP2,其中VP2 是CPV 核衣壳的主要构成蛋白,具有抗原性,可诱导机体产生抗体[3]。

发现该病后,疫苗很快就被应用到临床上,主要以最初的CPV-2 型作为疫苗株。随着使用时间的推移,疫苗的免疫效果出现了明显下降。研究发现,该病毒出现了抗原漂变,从而引发了对CPV 基因的研究[3]。CPV 变异速度很快,几乎与某些RNA 病毒相似,每个核苷酸每年出现约10-4的变异率[4]。CPV-2 型被确认后不久,1979—1981 年多个国家出现了CPV-2a 变异株[5],1986年第2 个抗原变异型CPV-2b 被发现[6],2001 年意大利报道了另一个新的变异型CPV-2c 亚型[7]。近期的一些研究表明,CPV-2c 型已经存在于很多国家,包括越南[8]、美国[9]、西班牙[10]、乌拉圭[11]和印度[12],这就逐渐验证了CPV-2c 将在全球范围内流行的猜想[13-15]。另外我国也出现了CPV-2c的相关报道,表明目前在我国CPV-2c 型正与其他亚型共同流行[13]。CPV 由于核苷酸的突变形成了不同的基因型,而基因突变造成了抗原漂变,抗原漂变又引起了疫苗免疫效果的下降,甚至免疫失败。为了解江苏省扬泰地区的CPV 分子特征和基因型,通过病原分离和鉴定,开展了分子流行病学调查,以期为今后该病防控打下基础。

1 材料与方法

1.1 病料

2015 年10 月—2016 年12 月,在扬州和泰州地区宠物医院,对临床表现有血样腹泻、体温升高、呕吐和脱水等症状,经胶体金试纸条检测为阳性或弱阳性的病犬进行病例信息收集,并采集泄殖腔棉拭子或粪便作为检测样品,记录所采样品的流行病学资料,-20 ℃冷冻保存。标准参考株,来自扬州大学兽医学院传染病实验室。

1.2 试剂和培养基

10% DMEM( 小 牛 血 清) 营 养 液、1%DMEM( 小 牛 血 清) 维 持 液、 无 抗 无 血 清DMEM、PBS 和1% PE(胰酶):均按常规方法配制。Taq DNA 聚合酶、200 bp DNA Ladder Marker 等:购自Fermentas 有限公司;Biowest Agarose:购自上海美季生物技术有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS):购自Sigma 公司。其他常规试剂,均为国产分析纯级产品。

1.3 实验仪器

台式高速离心机(TGL-16 型):上海医用分析仪器厂产品;PCR 仪(Bio-Rad S1000 型)和BIO-RAD3000XI 型电泳仪:美国BIO-RAD 公司产品;UV-2000 紫外分析仪:天能科技(上海)有限公司产品;50 mL 细胞培养瓶:江苏江阴三宝玻璃细胞培养瓶厂产品;20 μL 及200 μL 移液器:法国Gilson 公司产品。

2 方法

2.1 样品预处理和病毒分离

将样品用含有双抗(青链霉素)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)按照1:9 的比例稀释,并置于4 ℃过夜;接着8 000 r/min 离心10 min;取上清液,使用一次性微量过滤器(0.22 μm)过滤,然后接种于猫肾细胞系(FK81)并观察病变,盲传3代;将第3 代细胞毒,按照常规方法进行猪血血凝(hemagglutinin,HA)试验。

2.2 酚氯仿法抽提PCR 反应的DNA 模板

将疑似CPV 感染的样本分别接种FK81细胞,连传3 代,然后收获细胞培养液,用EasyPure®Viral DNA/RNA Kit 试 剂 盒 抽 提 病 毒DNA,-20 ℃冷冻保存备用。

2.3 PCR 扩增和序列分析

基因扩增引物参照文献[7]合成,序列见表1。将PCR 产物被送往上海生工生物技术有限公司进行测序,使用DNAstar 软件(Version 7.1.0)进行序列比对。

表1 CPV 基因分型引物

首先使用引物Pab 对样品进行分型,如果Pab扩增结果为阳性,再使用引物Pb 确定CPV-2b 亚型。如果Pb 扩增后的结果为阴性,就证实此样品毒株属于CPV-2a 亚型;如果结果为阳性,则属于CPV-2b 或2c 亚型,再根据测序突变与否,确定具体为何种亚型。

3 结果

3.1 病毒分离及HA 试验

样品接种约72 h 后,在FK81 细胞上形成典型的拉网状病变(图1-B)。接过毒的绝大多数细胞均发生肿胀、变圆以及脱落。共获得了48 个分离株。

HA 试验结果表明,盲传3 代后的病毒滴度在1:64~1:256 之间。

3.2 PCR 扩增

Pab 引物和Pb 引物PCR 扩增结果见图2、图3。根据PCR 结果可知,48 株病毒中,有4 株CPV-2、24 株CPV-2a(表2)。对剩余20 株进一步测序,以确定具体亚型。

3.3 427 bp 片段基因序列比对分析和基因型确定

经测序,发现剩余的20 株毒株均为CPV-2b型。核酸序列比对发现,该基因型在426 位(根据CPV-b,M38245 的核酸序列)没有出现G 到A的突变,也就是说在氨基酸残基426 位没有出现Asn/Asp426Glu 的突变,未发现CPV-2c 型突变株。最终确定的基因型见表3。

图2 样品Pab 引物PCR 扩增结果

4 讨论

图3 样品Pb 引物的PCR 扩增结果结果

表2 4 株CPV-2、24 株CPV-2a 分离株来源

表3 测序的20 株PCV 分离株来源与亚型

CPV 突变速率很高,与一些RNA 病毒一样,短期内可形成多种变异株[3-5],造成临床上疫苗免疫失效。鉴于对家养犬类和一些野生食肉动物健康的潜在威胁,人们对该病毒的变异情况越来越重视[15]。在各个国家和地区中,CPV 不同变异株所占的比例不尽相同[8-12]。我国犬类中,该病毒感染率很高,各种基因型均有,但有一定的地域差别[13]。

本研究对扬州、泰州地区采集到疑似CPV 感染的48 份样品进行了毒株分离鉴定与分型,结果发现CPV-2a 和CPV-2b 亚型的比例高,这与报道的CPV-2a 占主导地位的报道有很大的不同[14]。引起这个不同的原因可能有两点:第一,在强大的选择压力之下,我国的CPV-2a 亚型变异株正在不断地向CPV-2b 亚型进化;第二,扬州、泰州地区的CPV 变异株分布与北京地区本身就存在非常大的差异。本研究将分离株序列与Genbank 上发表的序列比较后发现了一些氨基酸残基的非同义替换。这些替换对CPV 生物学特性的影响还有待进一步研究。尽管在这次的扬州、泰州地区CPV 分子流行病学调查中并未发现CPV-2c,但因采集样品有限,仍不能排除CPV-2c 在该地区的存在。

目前使用的大多数疫苗都是基于最原始的1979—1981 年分离的CPV-2 型病毒的弱毒苗[16]。该疫苗在控制CPV 传播流行方面起到了重要作用[17]。而最新抗原型弱毒疫苗,能产生更为全面的保护力[16]。Decaro 等[5]研究发现,CPV-2c 感染犬所表现的临床症状往往较轻,引起的动物死亡率也比CPV-2a/CPV-2b型要低的多。然而在本研究中,鉴定为CPV-2b阳性样品来源犬的症状也都比较轻,甚至与一些报道的CPV-2c 引起的症状相一致,推测这可能是因为使用的其他基因型疫苗也产生了一定的交叉保护。

5 结论

综 上 所 述,2015 年5 月 至2016 年12 月,CPV-2a 型与CPV-2b 型在扬州、泰州地区占据了优势。疫苗的广泛使用导致犬感染后的临床表现并不严重,但新基因型毒株仍能造成一定的发病率和病死率,威胁着犬的健康,因此需开展深入研究来防控该病。

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