不同采收期江枳实挥发性成分的GC-MS 指纹图谱

邓可众， 陈 虹， 葛 菲， 熊 英*， 危先文

（1.江西中医药大学，江西 南昌330004；2.梅州市中医医院，广东 梅州514011）

枳实是常用的理气类中药之一，为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck 的干燥幼果，市场上药材来源多以酸橙为主。江西的酸橙植物资源极其丰富，江枳实为赣产道地药材，每年5 ～6 月收集自落的酸橙幼果入药。药材采收期是影响中药质量的重要因素之一，围绕枳实所含非挥发性成分如生物碱、黄酮类成分的分析检测已有较多报道［1-6］。枳实中也含有大量的挥发性成分，通常以柠檬烯的含有量较高［7-9］，并且挥发油、柠檬烯具有促进胃肠道蠕动、抗菌等活性［10-16］。虽对枳实挥发油的GC 指纹图谱已有相关研究［17］，尚未见采用指纹图谱对不同采收期枳实中挥发性成分进行动态分析的报道，GC-MS 联用技术为研究中药材挥发性成分提供便捷方法，课题组利用GC-MS 建立江枳实挥发性成分的指纹图谱，对16 批次不同采收期江枳实中挥发性成分进行动态分析，以期为江枳实最佳采收时间的优选提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 仪器Agilent7890AGC-Agilent5975CMS联用仪 （美国Agilent 公司）， 质谱检索数据库NIST11.L；XS3DU 电子分析天平（百万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；BS 224S 电子分析天平（万分之一，德国Sartorius 公司）。

1.2 材料 据产地调查酸橙于5 月中旬开始落花结果，生长至6 月底7 月初时的未成熟果实则作为枳壳药用，故江枳实的采集时间分别为2014年的5 月21 日、6 月1 日、6 月11 日、6 月21日，经江西中医药大学邓可众副教授鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果，信息见表1。

柠檬烯（批号H11M6Q1，含有量≥98%） 购于上海源叶生物科技有限公司；正己烷（分析纯，西陇化工有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，天津风船化学试剂公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取柠檬烯对照品溶于正己烷中，配制成质量浓度为94.80 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 挥发油提取 取枳实粉末（过3 号筛）20 g，加8 倍水，并在挥发油提取器上加2 mL 正己烷，加热提取5 h，冷却1 h，收集含挥发油的正己烷层，用1 mL 正己烷润洗挥发油提取器，合并正己烷溶液，用适量无水硫酸钠静置脱水12 h，取出正己烷溶液并定容至10 mL。

2.2 分析条件 Agilent HP-5MS 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；进样量1 μL；分流比1 ∶10；载气氦气；程序升温（初始60 ℃，以2 ℃／min 速率升到80 ℃，再以3 ℃／min速率升到100 ℃，保持1 min，再以5 ℃／min 速率升到180 ℃，保持1 min，最后以6 ℃／min 速率升到260 ℃）；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；四级杆温度150 ℃；质量扫描范围m／z 45～550。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一江枳实样品（S5），在“2.2” 项条件下连续进样6 针，柠檬烯（2 号峰） 为参照峰，测得18 个共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD 均小于0.40%。表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一江枳实样品6 份（S5），按“2.1” 项下方法制备样品，在“2.2”项条件下分别进样，柠檬烯为参照峰，测得18个共有峰的相对保留时间RSD 小于1.17%，相对峰面积RSD 小于3.14%。 表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一江枳实样品（S5），在“2.2” 项条件下， 分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，柠檬烯为参照峰，测得18 个共有峰的相对保留时间RSD 小于0.06%，相对峰面积RSD小于2.92%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 指纹图谱建立 4 个产地不同采收期的16批样品，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样，所得数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A 版，中位数法计算相似度，时间窗0.5，校准后得16 批样品挥发性成分的GC-MS 指纹图谱见图1，对照谱图见图2，共检识得到相对含有量较高的18 个共有特征峰。

2.5 指纹图谱分析

2.5.1 相似度分析 结果见表1，新干三湖镇6月上旬及樟树昌傅镇5 月下旬采收的S6、S13 号江枳实的相似度分别为0.861、0.875，其余样品均大于0.9，表明不同采收期江枳实的总体相似度较高；并且来自同一采集地点但不同采收期样品的相似度均以6 月中下旬的更高，故而从挥发性成分来看，以6 月中下旬采集的江枳药材质量的均一性相对较好。

表1 16 批样品相似度Tab.1 Similarities of sixteen batches of samples

图1 16 批样品挥发性成分GC-MS 指纹图谱Fig.1 GC-MS fingerprints of volatile components in sixteen batches of samples

图2 16 批样品挥发性成分GC-MS 对照图谱Fig.2 GC-MS reference spectrum of volatile components in sixteen batches of samples

2.5.2 共有峰分析 根据质谱库检索鉴定（匹配度＞90%） 共有峰成分名称及相关特征参数见表2，其中，包括6 个单萜烯类、6 个倍半萜烯类、4 个单萜醇及2 个酯类成分，16 批样品中各共有峰的面积归一化相对百分含有量见表3。所有样品中均以柠檬烯相对含有量为最高（15.0%～40.0%）、其 次 芳 樟 醇 （8.1% ～25.8%）、 大 根 香 叶 烯（7.9%～15.9%） 的含有量较高。同一采集地4 个不同采收期进行比较，可以明显看出主成分柠檬烯的相对含有量随果实生长、成熟度增加呈现上升趋势，见图3。

图3 16 批样品中柠檬烯相对含有量变化Fig.3 Variation tendency of relative content of limonene in sixteen batches of samples

表2 各样品中共有的挥发性特征成分Tab.2 Common volatile components of various samples

表3 16 批样品共有峰成分相对含有量（%）Tab.3 The relative content of common components in sixteen batches of samples（%）

3 讨论

对枳实挥发性成分的提取比较了水蒸气蒸馏提取与溶剂提取法，其中溶剂提取法考察了乙醚和石油醚（30～60 ℃）2 种溶剂以及超声与回流2 种方法。结果表明超声与回流提取无明显差异，提出挥发油的含有量与种类相差不大，乙醚与石油醚的提取率也无明显差异，水蒸气蒸馏与溶剂提取法均能获得低沸点的挥发油，但溶剂提取法可同时提出较多高沸点、非挥发性成分，即便升温达300 ℃，高沸点化合物仍没有检测完全，故而选择水蒸气蒸馏提取。因提取后水、油分离不便，故在挥发油提取器上端加入适量正己烷，并考察提取时间3、4、5、6 h 对提取率的影响，进样分析发现随着提取时间的延长，各成分含有量逐步增加，5 h 提取率可达6 h 的95%，故选择5 h。

不同采收期江枳实药材中所含挥发性成分的种类类似，但在相对含有量上有较大差异。来自同一采集地点、不同采收期江枳实的相似度均以6 月中下旬的更高，且柠檬烯亦以6 月中下旬的相对含有量较高。课题组前期进行了江枳实的UPLC 指纹图谱研究［18］，不同产地及不同采收期江枳实所含非挥发性成分亦十分相似，含有量以6 月中旬为最高，然而生长至6 月下旬的果实进一步膨大通常产量相对更高，综合分析两类成分的动态变化及产量，建议6 月中下旬为最佳采收期。