西洋参根腐病与人参皂苷积累关系

蒋景龙， 余 妙， 李 丽， 任绪明， 焦成瑾， 曹小勇， 徐 皓， 彭 浩

（1.陕西理工大学，陕西 汉中723001；2.天水师范学院，甘肃 天水741001）

西洋参Panax quinquefolium L.是五加科人参属多年生草本植物，与我国传统人参均是名贵中药材，被誉为“绿色黄金”，其主要活性成分皂苷等具有抗衰老、抗肥胖、抗高血糖以及提高免疫力、保护心血管系统病等药理活性［1］。陕西汉中留坝县自然生态环境得天独厚，适合栽培西洋参，目前留床面积甚广，约173 hm2，年产鲜参100 000 kg［2］。西洋参为宿根性草本植物，栽培过程中存在严重的连作障碍问题，即在同一块土壤中连续栽培同一植物或近缘植物时，即使在正常管理下也会出现病害加重、品质下降和产量减少等现象。根腐病是目前公认的导致西洋参连作障碍的最主要原因，常年发病率10%～30%，严重时高达70%，其染病后根部腐烂枯死［3］，是制约西洋参可持续发展的瓶颈问题。

近年来，越来越多的学者对西洋参根部病害起因的探索普遍转向土壤理化性质及根际微生物的研究［4-6］，并发现其根分泌物化感作用可能起重要作用［7-8］。化感作用是生物通过向周围环境分泌释放特定的次生代谢物，从而影响其他邻近生物或自身，以获取一种竞争优势的生态现象，其在植物及微生物中普遍存在。余妙等［9］研究了西洋参水提物对8 种农作物化感效应的影响，筛选出小麦适合作为当地西洋参的轮作作物。在现有的研究中，从西洋参中分离出的化感物质种类较多，如萜类人参皂苷、酚酸类、脂肪酸类等均是常见的代谢物［10］。高微微等［11］发现不同严重程度的西洋参病根中Rg1、Re 和Rb1含有量呈现复杂的变化规律；Rahman 等［12］比较了患锈根症状的组织与临近的健康西洋参组织，发现人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd 含有量下降40%～50%；毕晓宝［13］检测出西洋参土壤中含有微量的人参皂苷单体；张秋菊等［14］报道了西洋参采集时间、地段和参龄不同，土壤中总皂苷含有量明显不同；Nicol 等［15］发现西洋参通过根系向环境中释放少量人参皂苷，并影响了某些病原菌的生长；Yousef 等［16］报道了在离体条件下，腐霉属真菌Pythium irregulare 可降解人参皂苷。西洋参发生根腐病后，根内的酚酸类物质如p-香豆酸、阿魏酸［12-17］及人参皂苷Re［11］、Rb1［18］含有量显著增加，表明这两类化合物可能与宿主的防卫反应有关［19-20］；焦晓林等［20］发现皂苷提取物质量浓度达40 mg／mL 时，对4 种病原菌（立枯丝核 菌 Rhizoctonia solani、 茄 病 镰 刀 菌 Fusarium solani、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans） 均有显著抑制作用，推测在西洋参抵御病原菌侵染中，所含的皂苷类成分是重要的化学防御物质。然而系统性地研究不同生长年份的健康与患根腐病西洋参及其根际土壤中人参皂苷含有量变化规律的还很少。本研究以1～3年生健康与患病西洋参及其根际土壤为材料，检测土壤的理化性质与微量元素含有量并采用HPLC 法测定其中4 种人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和总皂苷含有量并分析其变化规律，探究西洋参根腐病的发生与皂苷积累之间的关系，以期为解决西洋参根腐病提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集 1～3 年健康与患根腐病西洋参及其根际土壤于2018 年4 月采自陕西省汉中市留坝县闸口石村佳仕森西洋参种植基地（33°38′N，106°43′E），海拔1 701 m，温度22.5 ℃，湿度29.8%。在1～3 年生西洋参采样地采用对角线取样法采集西洋参，用小铲小心挖取西洋参并保留附着于西洋参根上的土壤一同装入自封袋中，健康参与患根腐病参分开。其中，1 ～3 年生健康和患病西洋参样本须根与主根分开。用于土壤理化性质与微量元素含有量测定的土壤同样采用对角线取样法，健康参与病参根际土壤分开，所有土壤样品分别去杂过2 mm 筛。所得实验材料均放入-20 ℃低温冷藏备用。

1.2 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪、Waters 2489 紫外检测器（美国Waters 公司）；Inertsil ODS色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；KQ-300DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224S-CW 电子分析天平（德国Sartorius 公司）；UPH®-I-5／10／20T 超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）。

1.3 试剂 人参皂苷Rg1（批号110703-201128）、人参皂苷Re （批号110754-201324）、 人参皂苷Rb1（批号110704-201223）、人参皂苷Rd（批号111818-201302） 均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈、甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；水为超纯水。

1.4 供试品溶液制备 取1 ～3 年生健康与患根腐病西洋参须根和主根各0.5 g，每个样品均设置3个平行重复，分别加入5.0 mL 色谱甲醇，冰浴中用研钵研磨，再移入离心管中。超声提取30 min后，12 000 r／min 高速离心10 min。吸取上清液，再用0.45 μm 微孔滤膜过滤即得。1 ～3 年生健康与患根腐病西洋参根际土壤分别取5.0 g，分别加入15.0 mL 甲醇提取，随后超声提取离心；相同方法制备根际土壤供试品溶液。

1.5 土壤理化性质与微量元素测定 分别采用电位测定法、碱解扩散法、碳酸氢钠法、乙酸铵提取法检测土壤中pH 以及速效氮、速效磷、速效钾的含有量；使用火焰原子吸收法测定土壤样品中Mn、Ni、Ca、Zn、Cu 等微量元素的含有量。土壤pH、速效氮、速效磷、速效钾与Mn、Ni、Ca、Zn 和Cu 等微量元素的含有量测定均参照何宛晟等［21］的方法。

1.6 样品中皂苷含有量测定

1.6.1 色谱条件 Inertsil ODS 色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱（0 ～33 min，19%A，81%B；30 ～55 min，19%～45%A，81%～55%B）；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长203 nm；进样量20 μL。

1.6.2 线性关系考察 分别精密称取对照品人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 适量，加色谱甲醇分别配制成1.5、1.0、1.0、2.0 mg／mL 的对照品溶液。各取4 种对照品溶液1.0 mL 混合振荡摇匀，即得对照品混合溶液，低温避光保存。用甲醇依次2 倍稀释，共6 次。在“1.6.1” 项条件下进样，以峰面积积分值为纵坐标（Y），以对照品质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表1。西洋参及根际土壤中皂苷色谱图见图1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

1.7 数据处理 实验数据采用SPSS 21.0 软件进行统计分析，并通过单因素方差分析对相关性指标进行显著性检验，P＜0.05 有显著性差异，P＜0.01

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质与微量元素 表2 表明，随着生长年份的增加，1～3 年生健康参根际土壤中pH、速效氮、Mn、Ni、Zn 和Cu 的含有量均逐年降低，速效钾含有量逐年升高而速效磷和Ca 含有量均呈现先升高后降低的趋势。1 ～3 年生患根腐病西洋参的根际土壤pH、Mn、Ni、Ca、Zn 和Cu 的含有量也逐年降低，而速效钾和速效磷的含有量则呈先升高后降低的趋势。与1 年生健康参根际土壤相比，1 年生病参根际土壤中速效氮含有量明显降低25.68%；Ni、 Ca 含有量则显著升高114.46%、56.13%。2 年生病参根际土壤pH 较2 年生健康组显著增加6.80%。而3 年生健康西洋参和根腐病西洋参的根际土壤各项指标无显著变化。

表2 健康与患病西洋参根际土壤理化性质与微量元素含有量（n＝3）Tab.2 The physicochemical properties and the contents of trace elements in rhizosphere soil of healthy and diseased Panax quinquefolius（n＝3）

2.2 须根中人参皂苷含有量 图2 表明，在1 ～3年生健康参须根中，Rb1和总皂苷含有量均逐年升高，Rg1和Re 含有量随生长年份的增长均呈现先升高后降低的趋势而Rd 含有量先降低后升高。在1～3 年生患病参须根中，Rd 含有量逐年降低而Rg1、Re、Rb1和总皂苷则呈现先升高后降低的趋势。1 年生患病参与健康参相比，须根中Rd 含有量显著升高41.33%；3 年生患病参与健康参相比，须根中Rb1、总皂苷含有量均显著降低，分别降低24.06%、19.88%；而2 年生健康参与患病参须根中4 种皂苷和总皂苷含有量均无明显变化。在健康参、病参须根中，4 种皂苷的含有量Re 最高，Rb1和Rd 含有量相当，Rg1含有量最低，含有量分别为5.92 ～8.67、2.87 ～5.03、2.61 ～4.89、0.60 ～1.02 mg／g。

图2 健康与患根腐病西洋参须根中4 种人参皂苷及总皂苷含有量（n＝3）Fig.2 Contents of four ginsenosides and the total ginsenosides in fibrous roots of healthy and diseased Panax quinquefolius（n＝3）

2.3 主根中人参皂苷含有量 图3 表明，1 ～3 年生西洋参主根中，除了健康参与患病参中Rb1含有量变化趋势不同，分别呈逐年升高和先升高后降低的趋势，人参皂苷Rg1、Re、Rd 和总皂苷含有量在健康参与患病参中变化趋势均一致，其中，随着生长年份的增加，健康参与患病参中Re 和总皂苷含有量均呈先升高后降低的趋势，Rd 含有量均逐年升高而Rg1含有量均呈逐年降低的趋势。与1 年生患病参主根比较，健康参中Rg1含有量显著升高40.60%；与3 年生健康参主根比较，患病参中Rb1含有量则明显降低21.30%；而2 年生健康参与患病参须根中各含有量均无明显变化。在1 ～3年生西洋参主根中， 健康参与患病参种， Rg1、Re、Rb1、Rd 及总皂苷含有量分别为0.37 ～1.42、3.43 ～6.02、 1.51 ～3.38、 0.75 ～2.84、 7.39 ～11.93 mg／g。

图3 健康与患根腐病西洋参主根中4 种人参皂苷及总皂苷含有量（n＝3）Fig.3 Contents of four ginsenosides and the total ginsenosides in taproots of healthy and diseased Panax quinquefolius（n＝3）

2.4 根际土壤中人参皂苷含有量 表3 表明，1 ～3 年生健康与患病西洋参根际土壤中均未检测到人参皂苷Rg1和Re，相同生长年份健康参根际土壤中Rb1、Rd 及总皂苷含有量均高于患病参根际土壤。随着生长年份的增加，1 ～3 年生健康参根际土壤中Rb1、Rd 及总皂苷含有量呈现降低的趋势；在1～3 年生患病参根际土壤中，Rb1 含有量逐年降低而Rd 和总皂苷含有量则呈先降低后升高的趋势。其中，与1 年生健康西洋参根际土壤中Rb1含有量比较，2、3 年生健康西洋参根际土壤中Rb1含有量分别显著降低39.29%、67.86%；与1 年生健康西洋参根际土壤中Rd 和总皂苷含有量比较，2 年生中含有量无显著变化，而3 年生中含有量均显著下降，分别下降56.12%、58.08%；在1 ～3年生患病西洋参根际土壤中Rb1、Rd 及总皂苷含有量则均无显著变化。在健康参根与病参根际土壤中，人参皂苷Rd 含有量高于Rb1含有量。

表3 健康与患根腐病西洋参根际土壤中4 种人参皂苷及总皂苷含有量（mg／g，n＝3）Tab.3 Contents of four ginsenosides and the total ginsenosides in rhizosphere soil of healthy and diseased Panax quinquefolius（mg／g，n＝3）

3 讨论

土壤环境恶化是药用植物长期栽培的必然结果，其通常表现为土壤养分缺乏、酸碱度失衡、有害盐类含有量以及土壤化感物质增加等［22］。本研究对1～3 年生健康和患根腐病西洋参根际土壤的理化性质及微量元素进行了测定，结果显示土壤pH 值始终处于5～6 之间，且随栽参年限的增加酸化加重；Mn、Ni、Zn、Cu 等微量元素的含有量随栽参年限的增加，呈现显著降低趋势，且健康参土壤组中含有量低于患病组，表明西洋参患病后对土壤养分吸收能力下降。土壤酸碱度的持续降低会破坏水稳性团粒结构，不利于西洋参生长发育；土壤板结会导致根腐病的发生［23］；土壤中N、P、K、Ca、Zn 和Cu 等元素含有量失衡会使植株新陈代谢失调、抗病能力减弱，易引起植物生理病害［24-25］。单润忠［26］、栾泰龙等［27］发现了不同人参用地土壤均呈酸性，且随年份的增加酸化严重；何宛晟［21］发现不同年限人参根际土壤的理化性质及各元素含有量基本呈现降低趋势。土壤酸化有可能是西洋参根际分泌物如酸类物质的渗透，以及酸性微生物逐年大量繁殖的结果。

本研究发现在1 ～3 年生西洋参须根中，同一年份的健康参Re 含有量均高于患病参中含有量，3 年生健康参中总皂苷含有量显著高于患病参；在1～3 年生西洋参主根中，除了1 年生健康参中Re和Rd 含有量低于患病参中含有量，其他同一年份的健康参中4 种人参皂苷和总皂苷含有量均高于患病参。有研究报道，患病的西洋参根中人参皂苷Rg1、Re、Rb1之和低于正常参根，其中Rb1受根病的影响最明显，其含有量则随病害加重显著降低于正常参根［11］。Rahman 等［12］发现了患病参组织中6 种人参皂苷含有量较临近健康组织中的含有量均显著降低。通过检测土壤样品可知，1 ～3 年生土壤样品中均未检测出Rg1和Re，而含有少量的Rb1和Rd；并发现相同生长年份的健康参中4 种人参皂苷及总皂苷含有量均高于患病组，这与参样检测结果类似，表明健康西洋参代谢活性较强并向土壤中分泌较多的皂苷类。毕晓宝［13］检测了北京怀柔地区栽培的3、4 年生西洋参根际土壤，发现其中含有微量的皂苷单体Rb1、Rb2和Rd，在3 年生所有的测试样品中人参皂苷Rb1含有量最高。本研究发现1 ～3 年生土样中Rd 含有量明显高于Rb1，而Re 与Rg1均未检测出，人参皂苷含有量同样与毕晓宝［13］结果的含有量差异在2 个数量级，可能是因为不同的地理环境与栽培方式、不同的种植区域及生长年限，土壤中存留的人参皂苷种类和数量可能会有很大差别。人参皂苷作为西洋参主要的药用成分可能成为西洋参根腐病的化感因子之一，对西洋参根腐病的发生产生一定的影响，但在实际参地土壤的复杂基质中，究竟是以何种形式起作用还需要进一步研究。

总之，同一年份健康与患病西洋参土壤的理化性质和微量元素含有量、参根及根际土壤中各皂苷含有量变化均不明显，但随着西洋参生长年份的增长，健康和患病参中各指标变化显著，表明西洋参根腐病的发生与西洋参的生长年限以及人参皂苷含有量的积累均有关。然而人参皂苷并没有在西洋参根部病害中起主导作用，表明西洋参中可能存在其他的特异化感物质。任绪明等［2］发现西洋参根腐病的发生与西洋参根中β-ODAP 含有量的积累呈正相关，这表明β-ODAP 极有可能是导致西洋参根腐病的重要化感物质，然而西洋参的根系分泌物种类繁多，需要通过代谢组学系统的分析来确定主要的特异化感物质。毫无疑问，根腐病的发生与根际土壤环境和西洋参本身的生理状况均有关系，调查报告表明同一块地生长的西洋参，尤其是一年生的西洋参也有一定比例的发病植株，这一现象表明，西洋参个体之间的遗传差异可能与根腐病的易感性之间有某种关系，后期应重视西洋参发病过程中植株自身的代谢差异与西洋参自毒次生代谢物的代谢途径及其调控机制，以期揭开根腐病发生的真正原因。