基于网络药理学探讨全石榴“助胃火” 治疗功能性胃肠病的作用机制

李建良， 王朝鲁， 蔡淑珍， 图 雅

（1.中国中医科学院医学实验中心，北京100700；2.中国中医科学院望京医院，北京100102；3.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽028000；4.中国中医科学院中医药发展研究中心，北京100700）

全石榴为石榴科植物石榴Punica granarum L.的干燥成熟果实，蒙文名阿那尔，始载于《百方篇》，为巴达干病之贵药，蒙医药理论认为它具有助胃火、祛赫依巴达干、消食、开胃、止泻功能，主治消化不良、巴达干病、恶心、肺赫依、肝赫依、肾赫依、寒性腹泻、腹胀、嗳气等症［1］。在2013 版的《传统蒙药与方剂》 记载的22 个祛巴达干方子中，有10 个蒙药方使用了石榴。

功能性胃肠病是一种常见的反复发作的慢性胃肠道疾病，目前它没有明显病理改变和生化机制的解释，约40%患者主要有不明原因的腹痛、腹胀、餐后饱腹、早饱、腹泻、便秘等临床表现。在胃肠道疾病患者中，有一半被诊断患有功能性胃肠病［2］，而功能性消化不良和肠易激综合征被认为是最常见的种类，在亚洲其患病率为5%～30%［3］，而在全世界范围内为9%～23%［4］，虽然它不会危及生命，但可严重影响患者生活质量，并造成较重的经济负担。

国内学者［5-7］陆续提出了中医药与网络之间的假设，论述了计算机生物系统与中医药“整体、辨证” 观念之间的关系，应用网络药理学从现代医学角度探讨了单味中药［8］、中成药［9-10］等作用机制。在民族药研究中，不少学者［11］提出了“互鉴互融” 的理念，借鉴中药现代研究模式达到药效物质、作用机制、民族医药理论与经验特征基本清楚的目的。本研究通过该方法，从整体上对全石榴“助胃火” 治疗功能性胃肠病的作用机制进行初步探讨，也为后续研究提供一定的理论基础。

1 方法

1.1 候选化合物获取 通过TCMSP 数据库（http： ／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）、 化 学 专 业 数 据 库 （http： ／／www.organchem.csdb.cn／scdb／default.asp） 对全石榴化合物进行搜集。再利用PubChem（https： ／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／） 数据库，下载候选化合物的Sdf（*.sdf）格式文件，并转化为标准的Canonical SMILES 格式保存。

1.2 活性化合物筛选 基于SwissADME 平台来预测候选化合物吸收度和类药性的相关参数，将“1.1” 项下sdf 格式文件上传至Swiss ADME（http： ／／www.swissadme.ch／）平台［12］。首先，设定肠胃吸收 （gatrointestinal absortion；GIabsortion） 为“High” 结果作为药物可以被吸收的条件，用于筛选具有较好口服生物利用度的活性化合物；其次，设 定5 种 类 药 性 预 测 （Lipinski、 Ghose、 Veber、 Egan、Muegge） 结果中有2 个及2 个以上为“Yes” 的化合物，即可作为活性化合物。

1.3 活性化合物靶点预测 将SMILES 格式文件导入Swiss Target Prediction （http： ／／www.swisstargetprediction.ch／）平台［13］，设置属性为“Homo sapiens”，收集预测到的所有靶点，并对靶点进行除重。

1.4 全石榴“助胃火” 潜在靶点搜集 以“functional gastrointestinal disorders” 为 关 键 词， 通 过OMIM （http： ／／www.omim.org／）、 DisGeNET （http： ／／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／home ）、 DiGSeE （ http： ／／210.107.182.61／geneSearch／）、 GeneCard （http： ／／www.genecards.org／）4 个疾病靶点网站搜集功能性肠胃炎的基因，去除掉重复靶点基因，与“1.3” 项下靶点进行匹配，最终获得潜在靶点。

1.5 生物过程与通路富集分析 Metascape 平台是一个基因注释分析数据库，不仅能提供全面的功能注释，而且拥有数据库更新及时、使用免费、操作简便等特点［14］。将潜在靶点放入Metascape 平台，对全石榴潜在靶点进行GO 注释分析及KEGG 通路分析，保存其结果，并通过Cytoscape3.5.1 和GraphPad Prism 7.0 软件对结果可视化。

1.6 “活性成分-靶点-通路” 网络构建 将全石榴活性成分、潜在靶点、代谢通路数据导入Cytoscape3.5.1 软件，通过Merge 工具构建网络。

2 结果

2.1 活性成分 全石榴中富含多种化合物，主要为鞣质、酚类、黄酮、花青素、生物碱、不饱和脂肪酸等。基于TCMSP、化学专业数据库，通过筛选口服生物利用度、类药性，最终获得34 个具有较高活性的成分，见表1。

表1 全石榴活性成分

2.2 潜在靶点 基于Swiss Target Prediction 平台得到524 个基因靶点， 删除重复项后得到216 个。 通过与DisGeNET、OMIM、DiGSeE 疾病数据库中功能性肠胃病的相关靶点进行比对，最终筛选出86 个潜在靶点，见表2。

2.3 基因功能和通路富集分析

2.3.1 GO 注释分析 GO 注释分析由分子功能（molecular function）、 生 物 过 程 （biological process）、 细 胞 组 成（cellular component）3 个部分组成，共同描述基因生物学功能。将全石榴抗功能性胃肠病的86 个靶点上传到Metascape 平台，设置阈值P＜0.01，minimum count 3、enrichment factor＞1.5，共收集到314 条BP 条目、140 条MF 条目、59条CC 条目。由于BP、MF 条目数量较多，故Metascape 平台通过Kappa scores 作为相似性参数，将相似性＞0.3 的条目进行分层聚类分析，并采用Cytoscape3.5.1 软件绘制富集分析聚类网络图（图1 A ～1B），每个条目由节点表示，圆形大小与输入基因的数量成正比，而相同颜色的节点属于同一簇，每一簇当中选择P 值作为代表展示在右下角。具有相似性得分＞0.3 的条目由边连接，边的粗细表示相似性得分的高低，而细胞组分的可视化则采用GraphPad Prism 7.0 软件绘制其热图（图1C）。

全石榴活性靶点的BP 富集结果显示，大部分与钙离子 （Ca2＋） 调 节 相 关 （calcium ion transport、 positive regulation of cytosolic calcium ion concentration、 cellular calcium ion homeostasis 等）；MF 富集分析也提示，全石榴活性靶点与离子通道活性相关（calcium channel activity、ion channel activity、cation channel activity 等）。大量研究表明，Ca2＋在介导胃肠道平滑肌收缩反应中起核心作用，而平滑肌收缩和舒张是维持消化功能的基础；其次，BP 富集结果还聚焦于神经递质进程相关（regulation of neurotransmitter levels、 neurotransmitter metabolic process、 neurotransmitter biosynthetic process、 neurotransmitter catabolic process等）。现代医学认为，肠神经系统能够控制肠胃肠道运动、分泌、血流、水电解质转运等功能［15］，而靶点富集结果提示，全石榴能通过离子调节和神经递质等调控胃肠道的正常功能，这与传统蒙医认为全石榴具有“助胃火” 功效来进一步行使胃部的正常功能不谋而合。此外，MF 富集结果还提示， 全石榴与蛋白激酶活性相关 （protein kinase activity、 protein serine／threonine kinase activity、 protein kinase binding、protein kinase C activity 等）；CC 分析结果显示，活性靶点的细胞组分多种多样（图1C），以神经突出和膜系统为主。

表2 全石榴潜在靶点

2.3.2 KEGG 通路富集分析 通过Metascape 平台将全石榴活性靶点进行富集，共获得103 条KEGG 信号通路，筛选出21 条直接跟胃肠道疾病相关的信号通路，采用Graph-Pad Prism 7.0 软件对其结果进行可视化，见图2。信号通路包括信号分子的相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway）、神经递质（Serotonergic synapse、 Cholinergic synapse）、 脂代谢 （Arachidonic acid metabolism）、 信号转导 （Calcium signaling pathway、VEGF signaling pathway）、 细 胞 增 殖 和 死 亡 相 关 （Cell cycle、p53 signaling pathway、Apoptosis）、免疫系统相关（IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Leukocyte transendothelial migration、Inflammatory mediator regulation of TRP channels）、消化系统相关（Gastric acid secretion）、循环系统（Vascular smooth muscle contraction）、细胞运动（Regulation of actin cytoskeleton）。

2.4 “活性成分-靶点-通路” 网络 将全石榴活性成分、作用靶点、KEGG 通路信息导入Cytoscape 软件中构建网络，见图3。若某一靶点为活性化合物的潜在靶点，则以边相连，若某一蛋白对某条通路具有调节作用，也通过边连接。从图中可以看出全石榴同一活性成分对应多个作用靶点和全石榴的多个活性成分对应同一靶点的“一对多” 和“多对一” 作用关系，体现了全石榴多成分、多靶点治疗功能性胃肠病的作用特点。

3 讨论

蒙医药作为我国四大民族医药之一，是蒙古游牧民族同疾病抗争最有力的武器。蒙医认为，人体由三根（ “赫依” “希拉” “巴达干” ） 和七素（食物精华、血、肉、脂、骨、骨髓、精液） 组成，早在《四部甘露》 中就将胃比喻成锅，认为它是作为容纳食物的六腑中的第一大腑，食物精华的生成是人体进行新陈代谢的基础，消化吸收主要靠胃的火温完成，七素功能均要在三根作用下靠火温来完成，可见胃在维持人体功能的重要性。

三根中“巴达干” 偏盛将导致三根失调，机体清浊生活的功能紊乱，是一切寒性疾病的内因，治疗原则应以温性药助长胃火，清除“巴达干”。蒙医认为，全石榴味酸、甘，性热、锐、糙、动、腻、燥、轻，具有调理胃火、祛“巴达干” 寒症、消食、开胃、止泻的功效，能“助胃火”而驱除巴达干，恢复胃的火温而使其功能正常，临床上常配伍热性药以治疗消化不良、胃寒、恶心、胃肠胀鸣、腹泻等寒性“巴达干” 病症；现代研究表明，石榴皮醇提物能缓解乙醇造成的实验性胃黏膜损伤，促进胃黏液分泌，保护黏膜完整，从而治疗实验性胃溃疡［16-18］，其水提物对幽门螺杆菌甲硝唑耐药株、敏感株有体外抑制作用［19］，而石榴籽提取物能止泻［20］，同时还可调节胃平滑肌的收缩增强胃功能［21］。

图1 GO 注释分析图

图2 KEGG 富集分析图

图3 全石榴“活性成分-靶点-通路” 网络

GO 注释分析和靶点功能分析发现，全石榴治疗功能性胃肠病主要与配体受体结合、Ca2＋转运、离子通道进程、神经递质传递等生物过程相关，涉及细胞膜、神经元突触、离子通道等多种物质，参与离子跨膜转运、神经递质受体活性、离子通道活性等分子过程。Pathway 分析发现，全石榴活性靶点涉及Neuroactive ligand-receptor interaction、Serotonergic synapse、Cholinergic synaps、Calcium signaling pathway、VEGF signaling pathway、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、 T cell receptor signaling pathway、Leukocyte transendothelial migration、 Inflammatory mediator regulation of TRP channels 等通路与信号分子的相互作用，神经递质传递，免疫炎症相关，Gastric acid secretion 通路，能直接影响胃酸分泌。

现代医学研究表明，壁内神经系统、胃平滑肌、间质细胞构成了胃运动功能的基本单元，其功能异常是造成胃动力障碍、功能性胃肠疾病的重要原因，许多神经递质参与了致敏神经元，导致内脏高敏感性在肠易激综合征中起到着重要作用［22］，同时也与功能性消化不良时饭后胃痛、打嗝等症状相关。5-羟色胺（5-HT） 是参与调节胃肠运动和分泌功能的重要神经递质，其系统异常可导致胃肠动力及分泌功能异常、内脏高敏感性，与功能性胃肠病症状密切相关［22-23］。

本研究发现，石榴在治疗功能性胃肠病过程中与多种神经递质传递调节相关。常见的功能性胃肠病均伴随黏膜炎症，如功能性消化不良患者胃窦和十二指肠黏膜、肠易激综合征患者结肠黏膜均有炎症，其中前者又存在胃窦和十二指肠运动紊乱，从而进一步激发细胞免疫和体液免疫，导致黏膜炎症［24］。Meenakshi 等［25-26］报道，石榴果实能通过抑制促炎物质（iNOS、COX-2、IL-6［27］等） 表达，进一步下调PGE2、NO 生成，进而发挥抗炎作用；石榴皮醇提物可降低胃黏膜炎性因子 （MPO、 TNF-α、 IL-1β） 和VEGF 水平，进一步抑制溃疡发生［28］。现代医学认为，功能性胃肠病是“神经-免疫-内分泌” 失调所致［29］。本研究结果显示，全石榴“助胃火” 治疗功能性胃肠病也涉及了神经系统（Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、regulation of neurotransmitter levels、neurotransmitter metabolic process、 neurotransmitter biosynthetic process、neurotransmitter catabolic process）、免疫系统（IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、 Leukocyte transendothelial migration、 Inflammatory mediator regulation of TRP channels）、内分泌系统（Serotonergic synapse、Cholinergic synapse、Arachidonic acid metabolism）3 个方面，进一步证明了网络药理学在蒙药全石榴治疗功能性胃肠病的机制预测的可行性，但其具体靶点和通路还需要进一步验证。

综上所述，本研究基于网络药理学从全石榴34 个化合物、86 个靶点出发，建立成分-靶点-通路的生物网络，从整体上为该药材“助胃火” 提高胃肠道功能，治疗功能性胃肠病的作用机制提供理论依据，也为其他民族药相关研究提供借鉴。