MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3在胃低分化腺癌中的表达及意义

郭海州 安生花 林明哲 李进章 周毛 祁艳娟

(青海大学附属医院 1宁养院，青海 西宁 810001；2肿瘤内科；3肿瘤放疗科)

胃腺癌好发于中老年人，以低分化腺癌较多见〔1〕。淋巴结和淋巴管播散是其转移的主要方式，在病变形成时，间质可以观察到小的新形成的淋巴管。间质淋巴管是伴随着肿瘤的生长而形成的，与淋巴管促进因子有密切关系。血管内皮生长因子(VEGF)-D是新发现的淋巴管生成促进因子，通过VEGF受体(VEGFR)3起重要作用，促进D2-40阳性的淋巴管生成。肿瘤细胞侵袭性生长时可以浸润脉管，并通过淋巴道形成播散〔2〕。基质金属蛋白酶(MMP)家族不仅可以降解细胞外基质，破坏转移的屏障，还可以促进脉管的生成。MMP-12是家族中的一员，最早是在巨噬细胞中提取的。近年来认为MMP-12可能有多种功能，包括促进肿瘤生长及调节脉管生成的作用等〔3〕。本文关注胃低分化腺癌患者术后组织中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA的表达，探讨其关系，分析其临床意义。

1 材料和方法

1.1临床资料 选择2012年1月至2017年5月在青海大学附属医院确诊为胃低分化腺癌，并行手术根治的患者共73例作为研究组1，均经术后病理确诊，并符合世界卫生组织(WHO)中的诊断标准。本实验由医院伦理委员会批准。排除标准：①术前放、化疗的患者；②有消化系统手术史的患者；③伴有其他器官肿瘤的患者。其中男38例，女35例，年龄36～85岁，平均61.3岁。选择20例高-中分化胃腺癌术后组织作为对照组1，其中男10例，女10例，年龄37～80岁，平均58.6岁。选择20例胃黏膜高级别上皮内瘤变组织作为对照组2，其中男10例，女10例，年龄32～78岁，平均54.3岁。选择20例胃黏膜低级别上皮内瘤变组织作为对照组3，其中男10例，女10例，年龄34～76岁，平均54.1岁。选择正常胃黏膜组织20例作为对照组4，其中男10例，女10例，年龄39～79岁，平均62.4岁。选择胃低分化腺癌的新鲜组织12例作为研究组2，其中男6例，女6例，年龄43～75岁，平均61.5岁。选择正常胃黏膜组织的新鲜组织12例作为新鲜对照组，其中男6例，女6例，年龄42～73岁，平均61.6岁。以上各组间在性别、年龄构成等因素的比较中无明显差异。

1.2免疫组化检测MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表达 切片及染色基于石蜡包埋后的组织。MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的浓缩液均购自苏州睿赢生物公司，应用免疫组化SP法进行检测。先行预实验，由病理医师观察，选择染色效果最理想的浓度用于正式实验，即MMP-12是1∶300，VEGF-D是1∶200，VEGFR-3是1∶200。正式实验由同一技师完成，一次性完成，做好质控工作，减少人为误差。

1.3荧光PCR法检测MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表达 研究组2和新鲜对照组中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表达的检测应用荧光PCR技术。引物设计及扩增程序的设定见表1、2。操作严格按实验步骤完成，均由同一实验师完成，并设阳性对照和阴性对照，做好质控工作。

表1 引物设计

1.4MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3免疫组化结果的判定 MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的阳性部位均为细胞质和(或)细胞膜，结果判定由病理医师完成，选择上皮细胞集中的2个热点区进行观察(400倍)。应用阳性细胞百分比和着色强度综合判定。阳性细胞百分比：以0%、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别评定为 0、1、2、3、4 分。着色强度：以无、淡黄、棕黄、棕褐色分别评定为 0、1、2、3 分。两者相加，以最后评分作为最终判定分数，以≤3分为阴性，以>3分为阳性。

1.5MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3荧光PCR结果的判定 结果的判读以通道的循环阈(Ct)值为未确定的(Undet)或Ct值大于30为阴性，以Ct值小于等于30的样本为阳性，曲线为明显的S型。

1.6统计学方法 数据应用SAS6.12分析完成，行χ2检验、t检验、线性相关分析和Kaplan-Meier生存分析。

2 结 果

2.1研究组1、对照组1～4组中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表达的比较 五组中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表达差别有统计学意义(P<0.01)，即对照组4、对照组3、对照组2、对照组1、研究组1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表达阳性率有增高趋势。见表3、图1。

表3 各组MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表达阳性率比较〔n(%)〕

图1 MMP-12、VEGF-D、VEGFR-3蛋白在胃低分化腺癌中阳性表达(IHC，×200)

2.2研究组2和新鲜对照组中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表达 两组中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表达阳性率差别有统计学意义(P<0.01)。见表4、图2。

表4 研究组2和新鲜对照组MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表达阳性率的比较〔n(%),n=12〕

1：内控曲线；2：阳性曲线图2 MMP-12、VEGF-D、VEGFR-3 mRNA在胃低分化腺癌中阳性表达

2.3研究组1中不同临床特征中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表达的比较 研究组1 MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3与淋巴结转移和脉管累犯显著相关。MMP-12的表达与细胞增殖指数、肿瘤最大径和浸润深度密切相关(P<0.01)。见表5。

2.4研究组1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表达的相关性分析 研究组1中MMP-12和VEGF-D(r=0.41，P=0.041)、VEGF-D和VEGFR-3(r=0.46，P=0.021)之间均呈显著正相关性。

2.5研究组1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表达的生存分析 患者均进行随访，随访截止的时间为3～60个月，平均16.9个月。研究组1中MMP-12(χ2=3.95,P=0.033)、VEGF-D(χ2=4.25,P=0.014)和VEGFR-3(χ2=4.95,P=0.004)的阳性率均与患者预后显著相关(P<0.05)，即MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3高表达患者的预后差。

表5 研究组1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3阳性率在不同临床病理特征中的表达差别〔n(%)〕

3 讨 论

胃癌的淋巴结转移是主要转移途径，肿瘤细胞具有明显的播散性，迁移性强，患者常伴有脉管癌栓〔4〕。胃低分化腺癌是肿瘤细胞分化差的表达，也是胃癌的重要病理形态学类型，肿瘤细胞分布弥漫，细胞体积小，腺管形成少，易于转移和播散，临床侵袭行为强。研究认为淋巴管和血管受累提示肿瘤转移的可能性明显增强〔5〕。与淋巴道转移的相关蛋白近年受到学者重视，其中淋巴管生成是关注的热点之一。VEGF-D是新认识的淋巴管生成因子，其cDNA序列包括419个碱基对，其表达的蛋白包含354个氨基酸残基〔6〕。VEGF-D的受体是VEGFR-3。VEGFR-3被认为在机体发育中是必需的，尤其是在原始心血管系统的形成中有一定的作用。在恶性肿瘤形成时，VEGFR-3的分泌量明显增多，主要与淋巴管内皮细胞增殖分化有关，且主要表达部位是淋巴管的内皮细胞〔7〕。VEGF-D/VEGFR-3是肿瘤间质淋巴管形成时的重要通路，可以促进淋巴内皮细胞的形成。新形成的淋巴管呈枝芽状，以“出芽”的形式生长形成实性的条索状结构，在淋巴液的冲击和间质改建过程中形成有功能的淋巴管。由于新形成的淋巴管与肿瘤组织相邻，且结构和功能不完善，肿瘤细胞在生长时易于侵入，对淋巴道播散起重要促进作用〔8，9〕。关于VEGF-D/VEGFR-3通路的影响因素也有学者关注。梁任技等〔10〕通过观察非小细胞肺癌(鳞癌和腺癌)中MMP-12的表达，发现MMP-12能促进肿瘤的进展，同时可以促进VEGF-D的表达，认为二者可能对病变的形成有明显的作用，二者的关联性可能是治疗的靶点。MMP家族中有多个成员，结构上有一定的同源性，其特征性结构是含有锌和钙离子。MMPs均能对细胞外基质、基底膜、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白等间质成分进行溶解破坏，使肿瘤转移的屏障破坏，肿瘤细胞易于迁移〔11〕。MMP-12是家族中的重要成员，是作为弹性水解酶被认识的，研究认为MMP-12可以降解细胞外基质和基底膜的所有成分，其基因定位于11q22.3，cDNA全长1 800 bp，活化的MMP-12是以54 kD的酶原分泌，在水解作用后产生有活性的酶，可以激活MMP-2和MMP-3，引起MMP-12水解的级联反应〔12，13〕。近年研究认为MMP-12可能和脉管生成有一定关联〔14〕。

本研究结果显示研究组1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表达显著高于其他四组，正常胃黏膜、低级别、高级别、高-中分化腺癌、低分化腺癌中三者的表达有升高趋势，提示三者是促进病变形成的重要蛋白因素。结果显示低分化腺癌新鲜组织中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA高于正常组织，提示蛋白和mRNA的表达有高度的一致性。结果显示研究组1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3与淋巴结转移、脉管累犯有关，提示三者对促进肿瘤的转移有明显作用。相关性分析显示研究组1中MMP-12和VEGF-D、VEGF-D和VEGFR-3均具有正相关性，提示MMP-12可能是VEGF-D/VEGFR-3通路的重要影响蛋白，也提示MMP-12与淋巴管新生的作用可能是通过调节VEGF-D起作用的。胃腺癌中可见淋巴管新生，这为肿瘤转移提供了便捷的通路，肿瘤细胞易于播散，同时由于同质性黏附力的下降，肿瘤细胞易于离开原发病灶，进入脉管，并定植于异源性组织处形成转移灶。本实验结果显示MMP-12的表达与细胞增殖指数、肿瘤最大径、浸润深度密切相关，提示MMP-12可以促进肿瘤细胞的生长和侵袭，也提示低分化腺癌中MMP-12的作用方式可能更多元化。MMP-12在肿瘤细胞中的表达高，对肿瘤的侵袭和作用强，与癌基因的作用类似，同时对间质的作用更明显〔15〕。MMP-12还可能对肿瘤细胞周围炎性环境的调控有一定作用，引起癌性间质的活跃增殖，对促进转移可能与有一定意义〔16〕。本实验的生存分析证实MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表达与生存时间(预后)有关，即三者高表达患者的预后较差，这可能临床判断预后一定的价值。

综上，胃低分化腺癌中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3高表达且具有协同作用，对肿瘤的形成和进展有促进作用，MMP-12可能对淋巴管生成通路VEGF-D/VEGFR-3有一定的促进作用。