江口萝卜猪UCP2基因多态性与基因表达量及肉品质的相关性研究

张 继，吴 雪，邱淦远，刘鹏程，杨茂林，刘若余*

（1.贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省江口县科技局，贵州铜仁 554400）

解耦联蛋白基因（Uncoupling Protein，UCPs）家族的主要功能是氧化磷酸化的解耦联作用，作为线粒体内膜的质子载体，它可以将H+从外膜转运到内膜，降低H+在氧化过程中所产生的膜内外的电化学梯度，从而使呼吸链与ATP 合成过程解耦联，进而使氧化磷酸化合成ATP 的效率下降，能量以热能形式散发[1-2]。UCP2（Uncoupling Protein 2）是线粒体内膜上的一种蛋白质，是UCPs 家族中的一员，是生物能量代谢及功能调节的重要分子[3]。UCP2 具有“质子漏”功能[4-5]。Ricquier[6]研究表明UCP2基因在动物脑、肌肉、白色脂肪等组织中大量存在。已有研究证实UCP2基因与机体脂肪沉积有显著关联性[7-8]。如户国等[9]和赵文明等[10]的研究分别证明了UCP 基因上的SNPs 位点与肉鸡腹脂率和雪山鸡肌内脂肪酸含量存在一定关系。李晓燕等[11]研究表明，UCP2基因的表达与大鼠血清游离脂肪酸浓度呈正相关，与ATP 含量呈负相关，提示UCP2基因可能参与了疲劳运动中心的肌肉能量代谢。因此，很多研究者认为UCP 基因是影响牲畜和家禽生长和肉品质特征的候选基因[12-15]。

故本研究选择UCP2基因为候选基因，测定江口萝卜猪11 项主要肉品质指标，并提取背最长肌中的基因组DNA 和总RNA，构建DNA 池后直接测序筛选SNP位点，单个样本测序验证后进行分型，研究不同基因型猪肉质差异；荧光定量PCR 检测UCP2基因在江口萝卜猪背最长肌中的表达量，研究不同基因型猪表达量差异和表达量与肉品质性状间的相关性。以期筛选到良好的分子标记以辅助江口萝卜猪的选种选育，为更好的开发利用江口萝卜猪这一地方品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验猪由贵州省铜仁市江口县江口萝卜猪繁育中心提供。选择10～12 月龄江口萝卜猪144 头，平均宰前体重70 kg，平均瘦肉率41%。屠宰后取部分背最长肌、腰大肌用于测定其肉品质及DNA 提取，另取部分背最长肌组织于预装冻存液的冻存管中保存，用于提取RNA。

1.2 主要仪器与试剂 数显肌肉嫩度测定仪（C-LM3B，北京天翔飞域）、胴体PH 测定仪（PH-STAR，德国，Matthaus）、胴体肉色测定仪（OPTO-STAR，德国，Matthaus）、实时荧光定量PCR 仪（CFX96 Real-Time System 美国Bio-Rad），肉质品质分析仪（series3000，澳大利亚，NI）。

琼脂糖（Agrose，上海生工）、2×Taq MasterMix（康为世纪）、TRIzol（RNAiso Plus 日本 TaKaRa）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis（K1622 美国 Thermo Fisher Scientific）、iTaq Universal SYBR Green Supermix（美国 Bio-Rad）

1.3 肉品质测定 以《猪肌肉品质测定技术规范》（NY/T 821-2004）为标准测定剪切力、熟肉率、大理石纹、滴水损失等指标。肉色以Opto 值表示，Opto 值参考标准：Opto≥63 为优，即肉品质好；53≤Opto＜63 为良，即较满意；Opto≤53 为差，即肉品质有缺陷（PSE 肉）[16]。粗蛋白质、水分、肌内脂肪含量用肉品质分析仪测定，使用之前用索氏抽提法测定5 个样本校正。

1.4 DNA 池构建、RNA 提取及cDNA 第1 链合成 利用生工生物公司的Ezup 柱式动物基因组 DNA 抽提试剂盒提取肌肉组织中的基因组DNA，DNA 浓度和纯度使用紫外分光光度计测量，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测有无降解。然后将所有样本DNA 浓度调整相同至100 ng/μL，然后各取5 μL 混合，构建DNA 池。采用TRIzol 法提取江口萝卜猪背最长肌的总RNA，将所得RNA 浓度调整至500 ng/μL，用赛默飞公司的逆转录试剂盒（K1622）进行cDNA 合成，得到的cDNA 置于-80℃冰箱保存备用。

1.5 引物设计与PCR 扩增 参考NCBI 上猪UCP2基因DNA 参考序列（GenBank 登录号：NC_010451.4）和mRNA 参考序列（GenBank 登录号：NM_214289.1）以及猪内参基因β-actin，设计5 对引物用于扩增UCP2基因全部7 个外显子，另外设计1 对qPCR 引物用于检测基因表达量，并送由上海生工生物工程有限公司合成。引物扩增片段长度及最适退火温度见表1。PCR 反应体系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2 μL、ddH2O 4 μL。PCR 反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环后再72℃终止延伸10 min。PCR 产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳检查扩增效果。荧光定量PCR 反应体系（10 μL）：2×iTaq Universal SYBR Green Supermix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL（将逆转录得到的cDNA 稀释10 倍），无RNA 酶去离子水3 μL。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，60.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环；延伸完成后采集荧光信号。循环结束后进行熔解曲线分析：95℃ 10 s，60℃ 15 s，然后以每5 s 上升0.5℃的速率从60℃升高到95℃，每个样品做3 个重复。

1.6 统计分析 对混池测序筛选到的SNP 位点进行基因分型，并以单个样本DNA 为模板直接测序验证，统计不同基因型个体。利用Pop Gene32 软件计算群体遗传参数，包括基因纯合度（Ho）、基因杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）以及Hardy-Weinberg 平 衡 的χ2适 合 性 检 验。运 用SHEsis（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）在线软件进行连锁不平衡分析。利用SPSS 18.0 中的单因素方差分析对不同基因型个体肉品质性状进行差异显著性分析，结果用平均值±标准差表示。利用2-△△Ct法计算基因的相对表达量，研究不同基因型个体表达量差异，并用软件中双变量相关性分析研究基因表达量与肉品质性状之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果 以基因组DNA 为模板扩增UCP2基因全部外显子序列，以逆转录合成的cDNA 为模板，扩增UCP2基因和内参基因引物对应目的片段，分别取4 μL PCR 扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增图谱如图1。条带明亮、单一、整齐，无拖尾，说明基因引物特异性较好。扩增片段大小与实验预期引物设计目的片段大小一致。

表1 UCP2 基因引物序列、退火温度及片段长度

图1 UCP2 基因的PCR 扩增电泳图

2.2 PCR 测序分型 如图2 所示，在所有外显子序列中共筛选到3 个多态位点，以猪UCP2基因参考序列第1 外显子第1 位碱基位为+1，则这3 个位点分别为UCP2-T5728G、UCP2-T5774G、UCP2-C5878T，均在3´UTR 区。分别以每个江口萝卜猪DNA 为模板PCR扩增多态位点对应的外显子序列，然后测序验证多态位点（图3）。3 个多态位点均发现3 种基因型，并将与参考序列的相同的基因型个体定义为野生型，将不同于参考序列的纯合型个体定义为突变型，杂合个体定义为杂合型。

图2 混池测序结果

图3 单个样本测序结果

2.3 群体遗传参数分析 如表2 所示，等位基因频率差异均较大，优势等位基因频率明显高于其他等位基因，He 不高，Ne 较低，表明群体内变异程度较低，等位基因分布不均匀，PIC 均为中度多态，能提供的一定的遗传信息。χ2检验UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点处于Hardy-Weinberg 平衡，UCP2-C5878T 位点显著偏离Hardy-Weinberg 平衡。

2.4 连锁不平衡分析 如表3 和图4 所示，3 个位点之间存在连锁不平衡，且UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点为完全连锁不平衡。

表3 江口萝卜猪UCP2 基因SNPs 位点连锁不平衡分析

图4 UCP2 基因D´值和r2 值连锁图

2.5 不同基因型个体肉质差异分析 如表4 所示，对于UCP2-T5728G 位点和UCP2-T5774G 位点，3 个基因型间只有大理石纹差异显著，均为TT 型个体大理石纹评分显著高于TG 型个体。UCP2-C5878T 位点主要对剪切力有影响，3 种基因型个体剪切力差异达显著水平，其中野生型TT 型个体剪切力显著低于CC 型和CT 型。整体来看，UCP2基因上的SNPs 位点不同基因型个体主要在大理石纹和剪切力2 项指标中差异显著，其中杂合型个体大理石纹均为最低，剪切力均为最高。从肌内脂肪含量看，所有位点也均为杂合型含量最低。这一结果暗示UCP2基因可能在肌内脂肪沉积过程中起重要作用。

2.6 不同基因型个体UCP2基因表达量差异分析 如图5 所示，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点为杂合型表达量显著高于野生型和突变型，UCP2-C5878T 位点为杂合型和野生型表达量显著高于突变型。

表4 UCP2 基因不同基因型个体的肉质差异

图5 UCP2 基因不同基因型个体表达量

2.7UCP2基因表达量与肉质指标相关性分析 由表5可知，江口萝卜猪UCP2基因的表达量与pH1、失水率、滴水损失、剪切力、水份含量呈正相关，其中与剪切力呈极显著正相关；与pH24、肉色、大理石纹、熟肉率、肌内脂肪含量以及粗蛋白质含量呈负相关，其中与大理石纹和肌内脂肪含量呈极显著负相关。可见UCP2基因的表达量主要与肌内脂肪沉积相关，在一定范围内，UCP2基因表达量升高，肌内脂肪含量下降，大理石纹评分也随之下降，剪切力则随之升高，肉品质下降。

表5 UCP2 基因表达量与肉品质相关性分析

3 讨 论

UCP2基因作为解耦联蛋白家族的成员，在能量代谢中扮演着重要的角色，其与脂肪的沉积密切相关，UCP2基因变异很有可能会影响畜禽的生长性能和肉品质，国内外已有很多研究证实了这一推测。如蒋秋斐等[17]发现，UCP3 不同基因型西门塔尔牛个体生长性状之间存在显著或极显著差异；张娟等[18]研究发现，黑安格斯牛UCP3 基因多态位点不同基因型个体管围和体重存在显著差异；陈翠等[19]研究发现，UCP2基因SNPs 位点与饲料转化效率显著相关。本在UCP2基因上共筛选到3 个SNPs 位点，3 个位点均位于3´UTR，均不同于之前研究者所发现的位点。各位点普遍存在等位基因频率差异较大，优势等位基因频率明显高于其他等位基因，He 不高，Ne 较低表明群体内变异程度较低，可能是由于长期的人共选育或基因漂变造成的。连锁不平衡分析发现，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点为完全连锁不平衡。在基因型与肉品质的关联性分析中发现，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点野生型大理石纹评分显著高于杂合型，UCP2-C5878T 位点突变型剪切力显著低于杂合型和野生型，而且对比不同基因型个体背最长肌肌内脂肪含量，虽差异不显著，但也可以得到类似结果，说明UCP2基因上的SNPs 位点主要与肌内脂肪的沉积有关系，这与刘文超[20]发现UCP2基因上的SNPs 位点与家兔肉品质指标中的pH24极显著相关的研究结果不同，可能是因为物种差异所致，但UCP2基因多态性与猪的肉品质性能相关性尚未有研究报道。本实验中，在不同基因型个体背最长肌UCP2基因表达量的研究中发现，UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点为杂合型表达量显著高于野生型和突变型，UCP2-C5878T 位点为杂合型和野生型表达量显著高于突变型。UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点因为完全连锁，所以共同调控UCP2基因的表达，但为何在背最长肌中为杂合型表达量显著高于野生型与突变型，笔者猜想144 头江口萝卜猪虽是同一群体，但其中来源、类型不同，会发生不同类型间的杂交，产生杂合效应，使表达量增加，但具体调节机制有待进一步研究。而UCP2-C5878T 位点突变后，基因纯合时，会极显著降低UCP2基因在背最长肌中的表达量，说明UCP2-C5878T 位点的突变对UCP2基因的表达有不良影响。本研究发现UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点杂合型个体UCP2基因高表达，但是其大理石纹评分显著低于野生型和突变型，肉品质表现较差；UCP2-C5878T位点突变型UCP2基因表达量极显著低于野生型和杂合型，其剪切力也显著低于野生型和杂合型，肉品质表现较好。而且从肌内脂肪含量来看，也可以看出UCP2基因表达量高的基因型肌内脂肪含量低，肉品质差。因此，本研究认为UCP2基因的高表达不利于肌内脂肪的沉积，对肉品质有消极影响。最后，UCP2基因表达量与肉品质指标相关性分析结果验证了这一猜想，UCP2基因表达量与大理石纹评分和肌内脂肪含量呈极显著负相关，与剪切力呈极显著正相关。可以得出结论，UCP2基因表达量的增加不利于肌内脂肪的沉积，会导致肉品质变差。UCP2基因高表达对肌内脂肪沉积起消极作用可能与其生理功能相关，因其介导的氧化磷酸化解耦联作用，增加了脂肪酸的氧化分解供能，不利于肌内脂肪的沉积。但是由于猪属于中大型动物，很难做到大批同质个体的屠宰测定，而且畜禽肉品质受到多种基因调控，本研究结果还有待今后进一步扩大样本容量验证。

4 结 论

本研究在江口萝卜猪UCP2基因上筛选到3 个SNPs 位点，分别为UCP2-T5728G、UCP2-T5774G 和UCP2-C5878T，发现UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G位点野生型大理石纹评分显著高于杂合型，UCP2-C5878T 位点突变型剪切力显著低于杂合型和野生型；UCP2-T5728G 和UCP2-T5774G 位点为杂合型表达量显著高于野生型和突变型，UCP2-C5878T 位点为杂合型和野生型表达量显著高于突变型；UCP2基因表达量与大理石纹评分和肌内脂肪含量呈极显著负相关，与剪切力呈极显著正相关。研究结果表明，UCP2基因表达量的增加不利于肌内脂肪的沉积，会导致肉品质变差。