恩诺沙星对眼斑双锯鱼生理生化的影响

高鸿伟，胡静，杨蕊，周胜杰，于刚，马振华,通信作者

（1.仲恺农业工程学院，广州 510225；2.中国水产科学研究院 南海水产研究所 热带水产研究开发中心，海南 三亚572018；3.农业农村部 南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300；4.三亚热带水产研究所，海南 三亚 572018）

眼斑双锯鱼（Amphiprion ocellaris）又称公子小丑，外表酷似京剧中的丑角而得名，隶属于雀鲷科、双锯鱼属，是热带海水观赏鱼中的一种，因其健壮易养、活泼可爱而深受广大消费者喜爱，甚至供不应求，尤其是随着电影《海底总动员》播出，眼斑双锯鱼已成为炙手可热的海水观赏鱼种。有关眼斑双锯鱼的研究可追溯到上世纪50年代，为提高养殖效率以满足市场需求，同时降低对野生捕捞的依赖兼顾环保，多年来，众多学者对其展开了大量研究，包括发育学[1]、营养学[2]及病害学等方面，如Pirarat等[3]及Siva等[4]分别研究了眼斑双锯鱼和海葵双锯鱼的淋巴囊肿病的症状和组织生物学，但未见对其健康用药的相关研究。本研究以眼斑双锯鱼为研究对象，对其进行抗生素恩诺沙星浓度梯度浸泡试验，并对其相关生理生化参数如酶活性及氧化产物含量进行测定分析，为今后更好地利用抗菌药物提供一定理论依据。

恩诺沙星（Enrofloxacin）属于氟喹诺酮类药物（Ftuoroquinolones），又名乙基环丙沙星。其作用机理是与DNA回旋酶亚基A结合，从而抑制了酶的切割与连接功能，阻止了细菌DNA的复制，而呈现抗菌作用[5-7]。恩诺沙星被国家指定为动物专用药，因其具有广谱抗菌性及低残留等优势而广泛运用于动物疾病预防和治疗[8-10]，由于其药效显著，在水产养殖如鱼类养殖方面也渐渐得到广泛应用[11-12]，所以在水产养殖上对于恩诺沙星用药量就需要相关试验探索。因而本试验设置了0、5（说明书指定安全治疗浓度）和10 mg/L 3种恩诺沙星剂量对眼斑双锯鱼进行浸泡处理，探索其健康个体在恩诺沙星胁迫下生理生化的变化。应用分光光度法对眼斑双锯鱼不同组织消化酶、免疫酶活性及氧化产物含量进行测定分析，分析安全治疗浓度及高浓度处理下个体生理生化的差异，为眼斑双锯鱼的健康治疗用药量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以眼斑双锯鱼为试验对象，鱼苗由南海水产研究所热带水产研究开发中心陵水基地人工孵化而来，试验于该基地原地进行。试验前，苗种暂养于水族箱，充气泵充氧，保证溶氧量≥6.5 mg /L，循环水连续供应换水，盐度32±2，水温（28±1）℃，pH 8.0～8.2，亚硝酸盐含量小于0.03 mg/L，氨氮含量小于 0.01 mg/L。每天投喂两次人工颗粒饲料，试验前24 h停止喂食。

1.2 试验设计

称取恩诺沙星晶体，溶解于砂滤海水体积为20 L的储物箱中，配置浓度分别为0、5和10 mg/L的海水溶液，并根据Fang[13]之前报道的HPLC方法确定水体中恩诺沙星的浓度。其中0 mg/L处理组为对照组，说明书所示安全治疗浓度5 mg/L为中浓度处理组，10 mg/L为高浓度处理组，共计3组，每组3个平行。将90尾健康眼斑双锯鱼幼鱼个体（1.59±0.33）g随机放入以上9个试验容器中，每个容器10尾个体。试验容器连续充氧，各水质参数与暂养时相同。以说明书指定最长治疗时间24 h为试验时间，期间停止喂食。试验结束时，从每个试验容器中随机取3尾试验个体，取样时用6 mg/L丁香酚进行麻醉，用解剖刀剪取试验个体的胃、肠及肝组织，其中胃、肠组织用于消化酶活性测定，肝脏组织用于免疫酶活性及氧化产物含量测定。所取组织用生理盐水冲洗干净并置于液氮罐中进行冷激，后保存于-80 ℃冰箱中备测。

1.3 样品处理

各试验组所取样品称重（单位:mg）后，于0.2 mol/L 生理盐水中，按试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书指定比例分别进行研磨，研磨液2 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱中备测。蛋白、氧化产物含量及各酶活性测定分别采用相关试剂盒进行（南京建成生物工程研究所）。

1.4 数据处理

数据采用Mean±SD表示，试验数据通过SPSS 19.0 进行统计分析，先对数据作单因素方差分析（ANOVA），处理间若有显著差异，再用Duncan 法进行多重比较，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼幼鱼免疫酶活性的影响

恩诺沙星对个体肝脏免疫酶活性的影响见图1A～图1G。试验结果表明，恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼GSH、AKP、LZM、GST活性影响显著（P＜0.05），恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼 SOD、CAT、POD活性影响不显著（P＞0.05）。不同处理组间，GSH活性随处理浓度升高呈先降低后升高现象；AKP活性随处理浓度升高先升高后降低，但中、高浓度组不显著（P＞0.05）；LZM、GST活性随处理浓度升高呈上升趋势，但LZM活性在5 mg/L分别与0、10 mg/L差异不显著（P＞0.05），GST活性在0、5 mg/L差异不显著（P＞0.05）。

图1 恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼免疫酶活性的影响

2.2 恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼幼鱼消化酶活性的影响

恩诺沙星对个体肠道消化酶活性的影响见图2A～图2D。试验结果表明，恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶活性影响显著（P＜0.05）。不同处理组间，个体胰蛋白酶、脂肪酶活性随处理浓度升高呈先升高后降低现象，脂肪酶中、高浓度组差异不显著（P＞0.05），而胃蛋白酶随处理浓度的升高而降低。恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼淀粉酶活性影响不显著（P＞0.05）。不同处理组间，个体淀粉酶活性均无显著差异（P＞0.05）。个体淀粉酶活性大小随处理浓度的增加呈递减趋势。

图2 恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼消化酶活性的影响

2.3 恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼幼鱼氧化产物含量的影响

恩诺沙星对个体肝脏LPO、MDA含量的影响见图3A、图3B。试验结果表明，恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼LPO、MDA含量影响显著（P＜0.05）。但不同处理组间，个体淀粉酶活性均存在显著差异（P＜0.05），且个体LPO含量随处理浓度的增加而呈递增趋势，MDA含量随处理浓度增加呈递增趋势，且高浓度处理组个体MDA含量显著高于其他组（P＜0.05），中浓度处理组与对照组间差异不显著（P＞0.05）。

图3 恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼氧化产物含量的影响

3 讨论

在试验过程中，恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼3个处理组均无个体死亡现象，而机体免疫酶、消化酶及氧化产物含量在不同浓度恩诺沙星处理下存在差异，即不同参数受恩诺沙星处理影响程度不同。

3.1 恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼免疫酶活性影响

肝脏是水生动物如鱼类的重要免疫器官，大量研究表明，众多免疫反应主要发生在机体肝脏内[14]。免疫酶是动物免疫系统的重要组成部分[15]，主要包括抗氧化酶类和水解酶类，前者包括具抗氧化功能酶 GSH、SOD、CAT、POD等，能抑制和清除氧自由基，以保护机体免受氧化损伤；后者包括具排毒功能的酶类，如AKP、LZM和GST等[16]，能清除异物从而起到保护机体的作用[17]。各类酶功能不同，但又相互作用，共同完成一系列免疫反应，在不同环境胁迫下，不同酶活性变化不同[18]。

本试验研究中，眼斑双锯鱼GSH、GST活性对恩诺沙星较为敏感。GST是药物代谢Ⅱ相反应中一类重要的药物代谢转移酶，可催化相当多的外来物，包括大多数药物的代谢[19-20]，在10 mg/L浓度时，酶活性水平急剧增强，这可能是与 10 mg/L下GSH酶活水平的增强有关。陈琛等[21]研究表明，GSH作为生成GST的反应底物，二者可能同时对恩诺沙星起了应答作用，共同保护了肝组织。GSH活性随着浓度增加出现先降低后升高的现象，推测在恩诺沙星药物应激下，GSH结合GST功能起到了主要免疫功能，即在应对恩诺沙星应激的免疫反应中，排异反应起主导作用，抗氧化反应起次要作用，AKP及LZM的变化趋势亦证明了该推断。AKP是生物体内重要的解毒、排异体系[22]，个体肝脏AKP酶活性于安全治疗浓度处理下，即出现显著升高现象，证实5 mg/L时机体即受到胁迫且AKP活性升高以启动解毒、排异功能，而10 mg/L处理下，其活性的降低暗示该浓度可能超出了肝组织的解毒能力，抑制了AKP活性，该现象与蔡深文等[23]研究乳酸诺氟沙星对草鱼肝脏AKP影响结果一致。LZM作为水生生物生理防御水平的重要指标，是一种重要的非特异性免疫因子[24]，5 mg/L处理下，个体LZM活性虽然与对照组差异不显著，仅在10 mg/L时差异显著，但其活性与处理浓度呈正相关性，表明个体在药物刺激作用下，LZM的免疫即排异机能已逐步启动以对抗异物侵扰、保护机体免受损伤。张丽敏等[25]研究表明，高浓度恩诺沙星处理对红笛鲷LZM活性影响较小，与本试验的研究结果存在差异，因此高浓度对眼斑双锯鱼幼鱼LZM活性的影响规律还需进一步探索。不同酶对恩诺沙星所表现的应激有很大差异，显示了不同酶的不同功能及先后反应机理，亦反映了不同酶间的免疫反应关联，其内在机理有待进一步研究。本试验中，不同酶应对恩诺沙星不同浓度处理的变化规律，显示了即使在安全浓度处理下，机体酶活性即与对照组存在差异，甚至部分酶活性差异较显著，因此在给眼斑双锯鱼用药时应注意用量控制。

3.2 恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼消化酶活性影响

胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶均是消化系统中重要的消化酶。消化酶活性是反映鱼类消化生理机能的重要指标[26]。本试验中，除淀粉酶所受影响较小（各浓度处理间酶活性差异均不显著）外，其他3种酶受到恩诺沙星的影响较大。胃蛋白酶活性与恩诺沙星浓度呈显著负相关，于5 mg/L处理下即显著降低，说明中浓度恩诺沙星处理即已对眼斑双锯鱼的胃组织产生不利影响，致使胃蛋白酶活性受抑制，从而抑制其蛋白消化功能。而胰蛋白酶、脂肪酶活性变化趋势类似，于5 mg/L处理下即显著高于对照组，且随浓度升高呈下降趋势。这可能是由于胰蛋白酶有限制酶原分解、活化的作用[27]，机体内通过分泌胰蛋白酶来抑制胃蛋白酶原的分解，所以胃蛋白酶随恩诺沙星浓度升高而降低。脂肪酶活性的升高可能是由于机体需要更多能量来消除恩诺沙星对机体产生的影响，这与尹飞等[28]研究的低温胁迫促使脂肪酶活性升高的结果相一致。而随处理浓度的继续升高，各消化酶活性均呈下降趋势，结果表明高浓度恩诺沙星处理在一定程度上抑制了机体的消化性能，继而对其摄食活性产生消极影响。基于恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼消化酶活性影响的研究结果表明，不同消化酶应对恩诺沙星应激的变化规律不一致，这可能与各消化酶主要功能及个体的食性相关，眼斑双锯鱼为杂食偏肉食性鱼类，进一步证实了在药物应激下，个体胃蛋白酶活性反应最强烈，胰蛋白酶及脂肪酶次之，而淀粉酶最弱的结果。此外，部分消化酶如脂肪酶亦参与了抗氧化过程[29]，因此在某种程度上解释了，恩诺沙星对眼斑双锯鱼幼鱼脂肪酶的影响程度较淀粉酶更强烈的现象。

3.3 恩诺沙星浸泡对眼斑双锯鱼氧化产物含量的影响

氧化产物的含量反映了机体受毒害损伤的程度[30]。MDA含量反映膜质氧化的程度[31]，同时也是LPO链式反应的最终产物[32]。在Suna等[33]对大鼠口服硫丹的研究中，6周后个体心脏MDA含量升高。在 Atif等[34]对翠鳢的研究中，个体硫丹暴露24 h后，个体各组织LPO含量升高。本试验中，眼斑双锯鱼幼鱼肝脏MDA及LPO含量随恩诺沙星浓度的升高呈升高趋势，二者均在10 mg/L处理下活性最大，不同的是MDA含量于10 mg/L处理下与对照组差异显著，而LPO在5 mg/L即显著高于对照组。结果表明，个体在恩诺沙星浸泡应激下，肝脏积累了大量氧化产物，尤其是高浓度处理下氧化产物含量更高，结果表明此时抗氧化系统正在运作。至于机体所能承受的最大氧化产物（如 MDA、LPO）含量有待进一步研究，相关研究结果有助于判定在该试验所设定处理浓度下，个体机体肝脏是否受到损伤及损伤程度。

4 结论

恩诺沙星作为最具代表的有效抗生素药物而广泛应用于水产养殖，但其在使用时需针对不同的物种探索最适药用量才能达到最佳治疗效果，在消除病害的同时，把对个体组织的损伤控制在最小程度。本试验中，根据个体免疫酶、消化酶活性及氧化产物对恩诺沙星的应激反应综合分析得出，就眼斑双锯鱼幼鱼而言，最佳药用量应控制在5 mg/L以内，具体最适药用量还需进一步探索。