白魔芋花器官草酸钙晶体对隐翅虫的潜在防御能力研究

黄保国 唐 荣 陈 高,4 李新辉

( 1. 西南林业大学生态与环境学院，云南 昆明 650233；2. 云南省极小种群野生植物综合保护重点实验室，云南 昆明 650233；3. 中国科学院大学，北京 100049；4. 中国科学院东亚植物多样性与生物地理重点实验室，云南 昆明 650204)

草酸钙晶体广泛存在于植物组织中，研究发现至少有215科植物中含有草酸钙晶体[1]，且在植物的根、茎、叶、花、种子等都有分布[2-3]。草酸钙晶体在植物中具有多种不同的功能，如钙调控、解毒、离子平衡、植物的刚性支撑等[4-6]。此外，多数植物中草酸钙晶体的存在都具有保护植物不受动物取食的功能[4]。植物组织中的草酸钙晶体可以让植物变的难以下咽或对取食者产生伤害进而避免被大量取食，以达到保护自身的作用[2,4]。草酸钙晶体的类型、大小、位置和数量在对防止动物取食的效果上都会有影响[7]。Ward研究发现脊椎动物和无脊椎草食动物都避免取食巨型弹簧草（Pancratium sickenbergeri）草酸钙晶体含量最高的部位[8]。

天南星科植物组织中普遍存在草酸钙晶体[3]。该科植物中的草酸钙晶体存在于植物的各个部位，且具有非常丰富的变化[9]，Coté[10]研究了天南星科21种植物花序各部位中草酸钙晶体的多样性，发现不同部位的草酸钙晶体含量与天南星科（Araceae）植物类群传粉策略存在一定的因果关系。对天南星科植物中草酸钙晶体的研究主要集中在植物的营养器官上，而对于繁殖器官中草酸钙晶体的研究较少[10]。Prychid等[11]研究10种魔芋属（Amorphophallus）植物发现其叶片上具有不同类型的草酸钙晶体，Bernardino-Nicanor等[12]也发现草酸钙晶体的防御功能在植物体重要部位得到加强的现象。白魔芋（Amorphophallus albus）是天南星科魔芋属多年生草本植物[13]，是刘佩瑛等[14]于1984年发表的新种。白魔芋特有分布在金沙江干热河谷下游区域，如云南永善，四川金阳、屏山等[15]，该物种是当地特有的经济作物，相较于花魔芋来说，白魔芋块茎中葡甘聚糖含量更高，品质更好[16]。在前期对白魔芋开花过程的调查发现，白魔芋花期花序中聚集有大量的隐翅虫，隐翅虫在花序中交配、取食，并产卵，完成对白魔芋的传粉。花期结束后，白魔芋花序不同部分（不育区、雄蕊、附属物）均遭到不同程度的取食，但雌蕊区却未受到影响。为探寻导致白魔芋传粉昆虫产生取食偏好的原因，本研究通过分析花序各部位草酸钙的含量差异，探讨其与白魔芋花序不同部分被取食差异的潜在关系。

1 材料与方法

2018年7月，随机选取四川省金阳县洛解村（103°13′52.75″E，27°38′20.73″N，海拔 1 404 m）种植的白魔芋50株，统计其花序中隐翅虫的数量并用游标卡尺测量花序各部分（附属器、雄蕊、不育区和雌蕊，图1）被隐翅虫取食的比例。取食比例=被取食的长度/总长度。

选择12株2018年7月从四川省金阳县采集的带花序白魔芋植株，将整个花序的雌蕊区、退化雄蕊区、雄蕊区及附属物区采用手术刀片切割成1 cm的小块。然后用10% NaOH溶液浸泡48 h，再置于饱和的NaClO溶液中脱色48 h。脱色完成后在清水中进行漂洗，随后采用25%、50%、75%、100%梯度的乙醇进行脱水，最后采用纯二甲苯透明后用中性树胶封片，自然风干后在光学显微镜（OLYMPUS-BX51）10倍目镜下搭配佳能数码相机（CANON-EOS550D）下进行观察和拍照。每个植株不同部分的样品观察至少3个视野（每个视野面积1 250 μm2），花序不同区域一共观察累计不少于36次，统计样品内的草酸钙针晶胞的平均数量。

采用手术刀片分别将4株白魔芋花序中4个部分切割下来，每株的不同部分分别称取1 g鲜质量组织，用研钵捣碎之后用60%甲醇溶液5 mL过夜提取12 h。将各部位提取物过滤，浓缩后定容到2.5 mL；然后用移液枪吸取5 μL滴于隐翅虫头部，记录隐翅虫的活跃情况；同时用甲醇溶剂作为对照记录隐翅虫的行为。用秒表记录隐翅虫的死亡时间，如果超过1 min，隐翅虫继续爬行，则认为提取液不能杀死隐翅虫（5 μL溶液1 min后通常已经挥发完）。所用隐翅虫为2018年7月从四川金阳县带回昆明植物园进行饲养的成熟个体（数量大约5 000头，为金阳县白魔芋最主要的传粉昆虫）。样品加对照共计5个处理，每个处理用20只隐翅虫，重复3次。

上述研究中所有数据采用SAS 9.4进行单因素方差分析并进行LSD多重比较，同时采用Origin 8.0对所有数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 白魔芋花序各部位草酸钙晶体的含量及分布

白魔芋花序各部位草酸钙晶体的含量见表1。由表1可知，雌蕊子房中所含草酸钙晶体的数量最多，平均每个视野约为188.4个，LSD多重比较的结果表明其含量显著高于其他3个部位中草酸钙晶体的含量，见图1；其次含量高的部位是雄蕊区，平均含37.6个草酸钙晶体。而佛焰苞苞片和附属器中的草酸钙晶体的平均含量分别为25.3个和29.7个，多重比较分析表明雄蕊区、佛焰苞苞片与附属器三者之间的草酸钙晶体含量并无显著差异；花序各部位中草酸钙含量最低是不育区，平均仅11.8个，与雌雄蕊区均存在显著性差异。草酸钙晶体的形状主要有2种，存在一定的大小差异，长针晶80～120 μm，短簇晶胞针晶长度 30～50 μm（图1）。

表1 白魔芋花序各部分草酸钙晶体的含量Table 1 The content of calcium oxalate crystals in different sections of A. albus inflorescence 个/视野

图1 草酸钙在白魔芋花序不同部位的分布情况Fig. 1 Distribution of calcium oxalate crystals in different sections of A. albus inflorescence

图1 白魔芋花序中草酸钙晶体的分布情况Fig. 2 Distribution of calcium oxalate crystals in A. albus inflorescence

2.2 白魔芋花序中隐翅虫的数量及取食比例

本研究统计白魔芋花序中隐翅虫的数量显示，花序中隐翅虫的平均数量为293只（n=50），其中最多可达1 300余只，隐翅虫数量在白魔芋花序中的分布情况见图3。由图3可知，花序中隐翅虫的数量通常为100～700只，数量在100只以下或700只以上的植株相对较少。花序中不同部位被隐翅虫取食的比例见图4。由图4可知，隐翅虫主要取食部位是不育区，取食比例达到100%；其次是附属器（70%±30%，n=37），雄蕊区取食较少（23%±22%，n=37）而雌蕊区完全未被取食。多重分析结果表明4个部位被取食的比例均存在显著性的差异（P＜0.05）。

图3 白魔芋花序中隐翅虫数量的分布情况Fig. 3 Distribution of the amount of rove beetles in the inflorescence of A. albus

图4 白魔芋花序被隐翅虫取食的不同比例Fig. 4 Different proportion of the inflorescences of A. albus consumed by rove beetles

2.3 花序各部位甲醇提取物毒杀隐翅虫的效果

采用白魔芋花序4个部分60%浓度的甲醇提取物触杀白魔芋有效传粉者隐翅虫的结果见表2。由表2可知，附属器、雄蕊区、不育区及对照4个处理1分钟内均不能杀死隐翅虫，而雌蕊区的甲醇提取物对隐翅虫具有明显的毒杀效果，隐翅虫平均在14.5 s的时间范围内死亡。

表2 花序各部位甲醇提取物毒杀隐翅虫的效果比较Table 2 Comparison of kill ability of methanol extracts from different sections of A. albus inflorescence to rove beetles

3 结论与讨论

天南星科植物与其传粉者之间通常存在着互惠互利的作用关系，天南星科通过提供热量、食物或者产卵地吸引传粉昆虫访花并达到为其传粉的目的[17]。通过调查发现白魔芋在其盛花期时，花序中存在着大量的隐翅虫，隐翅虫在花序中主要行为是取食。统计隐翅虫对白魔芋花序不同部位的取食结果表明，隐翅虫主要取食的部位是不育区，取食比例通常达到100%，其次是附属器，当花序中隐翅虫数量过多而不育区作为食物不足时，隐翅虫会转而取食附属器（70%±30%，n=37）和一部分雄蕊区（23%±22%，n=37），但完全不会取食雌蕊区，这种情况在天南星科其他植物中也同样存在[18]。

本研究通过比较白魔芋花序不同部位中草酸钙晶体含量的差异发现，其雌蕊区草酸钙含量最高（188.4），而雄蕊区中草酸钙晶体的含量显著少于雌蕊。但雄蕊区草酸钙含量和附属器及佛焰苞苞片中的含量并无显著差异。考虑到白魔芋花序中雌蕊数量较少，通常为20～60个，而雄蕊数量在200个以上，花粉数量更是多达几十万个[15]，推测是否是过多的花粉也是传粉隐翅虫的传粉回报，因此没有太强的防御物质。毕竟传粉昆虫取食花粉并不会像取食胚珠那样对植物的繁殖产生明显影响。此外，投资是需要代价的，植物只需要在最需要保护的部位投资最多的防御物质，就能保护植物正常的繁殖过程。就整个花序而言，各个部分均含有草酸钙晶体，其中佛焰苞苞片可以保护花序展开前不受昆虫的干扰、雄蕊中的草酸钙晶体可以在其散粉前避免被取食掉所有花粉、附属器是天南星科植物特有的结构，也需要受到一定的保护作用（通常在传粉过程中扮演着气味散发和温度升高的作用[19]）。花序中草酸钙晶体含量最少的部位是不育区（退化雄蕊），该部位通常是天南星科植物提供给传粉昆虫的食物报酬，因此保护需求最低。植物由于附着生长不能运动，而只能通过物理防御或化学防御以防止被昆虫取食，在化学防御中草酸钙晶体通常扮演着重要的作用。Coté[10]研究21种天南星科植物也发现在重要的胚珠和花粉部分都有高含量的草酸钙晶体以保护该部位避免被昆虫取食，而退化雄蕊在不同种之间草酸钙晶体含量差异较大，其作用尚不明确。天南星科植物草酸钙在花序不同部位的结构组成变化及其不均匀分布的防御功能值得开展进一步的研究。

此外，为了验证花器官中甲醇提取物对隐刺虫的毒杀作用，采用花序各部位的甲醇提取物直接接触性毒杀白魔芋的传粉昆虫（隐翅虫），结果发现草酸钙晶体含量最高的雌蕊提取物能快速杀死隐翅虫。表明草酸钙晶体单独或与其他防御成分一起对隐翅虫具有较强的毒性。以前的研究发现草酸钙晶体的形态特征可以起到防御作用。如Tragia ramosa表明覆盖由伸长的刺细胞构成的蛰毛，细胞内含有大量草酸钙针状晶体，晶体侧缘形成沟槽。一旦动物碰到蛰毛会导致细胞破裂，针状晶体会刺破动物的真皮，而毒素沿着晶体表面的沟槽流到伤口会引起皮肤的刺痛感[6]。而Riuz等[20]对百合科植物叶片中草酸钙含量与动物的摄食量进行分析，发现较高的晶体含量与摄食减少之间存在明显相关性。上述研究均揭示草酸钙晶体的防御功能。

在植物的防御选择中，草酸钙晶体的防御过程是普遍的进化策略。一方面，草酸钙晶体可以通过本身的形态特征和数量来对取食的动物造成物理伤害；另一方面，在晶体周围还存在毒性蛋白[21]或者其他毒素物质[22]，对草食动物、啮齿类动物、真菌和昆虫也能起到防御作用[23]。本研究通过比较白魔芋花序不同部位草酸钙晶体的含量揭示了植物可能够通过草酸钙晶体的含量差异来选择性地保护其繁殖器官。