苦参种子硬实性的组织解剖学分析

崔芬芬，陈 亮，曹亚萍，王勇飞，乔永刚，宋 芸

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

苦参（Sophora flavescens Ait.）是一种多年生落叶亚灌木或草本的豆科槐属植物[1]，是常用的传统中草药，传统中药材以其干燥根入药，具有清热、燥湿、杀虫、利尿等功效[2]；苦参作为一种常用中药材，在许多国家包括我国、日本、韩国、印度和一些欧洲国家等都广泛使用[3]，在我国各地均有分布[4]。苦参的主要化学成分为生物碱和黄酮类化合物两大类[5]，其具有良好的抗菌生物活性[6]、抗血管生成[7]、抗肿瘤[8]、抗炎[9]和酪氨酸酶抑制作用[10]。另外，还对肿瘤细胞具有抑制作用[11]，作为植物杀虫剂具有良好的效果[12]。

苦参在中药学和现代医药学领域中都具有重要的地位，以往其化学成分和生物碱的分离提纯及药理作用是研究的热点[13]，但是对其解剖结构方面的研究和认识仍然是不全面的。目前，市场对苦参的需求量日益增加，但野生资源已无法满足市场需求，因此苦参的人工栽培具有十分广阔的前景。苦参的人工栽培主要以种子繁殖为主，但苦参种子具有高硬实性、低发芽率，导致苦参幼苗的严重短缺，这已成为阻碍苦参规范化、规模化栽培的障碍。

苦参具有硬实性，尽管引入“硬实”这一术语已超过100 a，但关于种子硬实性的研究仍有一定的不完善性和局限性[14]，硬实抑制种子的大规模生产和种植[15]，但目前关于硬实性的研究较少，仅在大豆等少量物种上有研究[16]。硬实性主要是由于种皮的限制引起的，种皮能够将内部物质与外部环境分隔开来，有利于种子的形态建成以及对于外界不良环境的抵抗，同时种皮也是外界化合物吸收进入种子的第一道屏障[17]。

为探索苦参种子硬实性形成的原因及生长过程中种皮的变化，利用石蜡切片技术从解剖学层面对苦参种子及不同发育时期的种皮解剖结构进行观察，以研究种子结构及种皮结构的变化，从而为苦参种子硬实性的鉴定与探索硬实性形成的原因提供细胞学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

收集山西和内蒙古共6 份苦参种子，选择籽粒饱满无虫害的苦参种子备用；并取山西太谷的成熟种子及不同生长发育阶段的新鲜种子，获得其种皮备用，取材从开花当天起每周取一次，直至成熟。

1.2 方法

1.2.1 种子硬实率的测定 将经过挑选后的苦参种子每份随机挑选3 个重复，每个重复50 粒，在室温条件下浸泡24 h，统计吸胀和未吸胀的种子数量，计算硬实率[18]（未吸水膨胀的种子）。

硬实率＝未吸胀种子数/供试种子数×100% （1）

1.2.2 种子石蜡切片制作方法 试验采用常规制片技术中最为广泛的石蜡切片法[19]制作切片。利用FAA 固定液对材料进行固定，抽气下沉后于4 ℃保存过夜。用蒸馏水多次冲洗，洗去固定液后开始脱水，利用不同浓度梯度的乙醇顺浓度梯度进行脱水，并利用番红O 进行染色。使用体积分数比为1∶1 的无水乙醇与二甲苯的混合液以及二甲苯溶液对材料进行透明，透明后对其进行浸蜡并包埋。然后，使用YD-1508R 轮转式切片机对包埋好的材料进行切片，切片厚度为8 μm。将切片干燥后利用二甲苯溶液及无水乙醇和二甲苯的混合液对其进行脱蜡、透明，然后利用不同浓度梯度的乙醇溶液逆浓度梯度进行复水，并利用甲苯胺蓝再次染色。最后，再次透明后利用封片剂封固。利用光学显微镜OLYMPUS BX51 观察，拍照并记录。

2 结果与分析

2.1 苦参种子硬实率统计

对6 个种源的苦参种子硬实率进行测定，结果如图1 所示，苦参种子具有很高的硬实性，6 个种源的硬实率都超过93%，其中，内蒙古赤峰和山西土河坪的硬实率最，均达98.7%；山西太谷的硬实率最低，为93.3%。

2.2 苦参种子的解剖结构特征

2.2.1 种脐的解剖特征 图2-b 所示为苦参种子的种脐部位，在种脐部位可以观察到两侧的株柄残余物及处于中间部位的维管系统。与珠柄残余物紧密相连的是致密且整齐排列的栅栏组织细胞层。珠柄残余物木质化后中间凹陷形成的缝隙为苦参种子的脐缝，在脐缝的下方是发达的维管系统，并且在栅栏组织细胞层下方分布有大量的石细胞。

2.2.2 种皮的解剖特征 苦参种子的种皮坚硬且致密。从图2-c 可以看出，苦参种皮由外至内依次是：角质层、栅栏组织、骨状石细胞、厚壁细胞及薄壁细胞。处于最外层的是角质层，主要起保护作用，是连续的长带状细胞，均匀地分布在种皮的最外层；与角质层紧密相连的是栅栏组织，其有利于物质的进出，由数层细长的长圆柱形细胞组成，排列紧密，呈栅栏状，与表皮细胞垂直；位于栅栏组织后的是骨状石细胞，由厚壁组织发育而来，该细胞两端稍膨大，形成“工”字形，由单层细胞组成，在细胞间存在很大的细胞间隙，主要起机械支持和保护作用；厚壁细胞是由多层呈横向排列的细胞组成，起支持作用；最后是薄壁细胞，是由一系列较小的不均匀排列的网状细胞组成。

2.2.3 子叶的解剖特征 图2-d 所示为苦参横切面的子叶部分，从图2-d 可以看出，子叶中的叶肉细胞整齐排列，子叶细胞中含有大量的淀粉粒，其 为种子的萌发提供，重要的营养物质。

2.3 不同发育时期种皮解剖特征的比较

对不同发育时期的种皮进行解剖分析，结果如 图3 所示，随着苦参种子的不断发育，种皮结构也发生了变化，在开花后第2 周，主要以角质层、栅栏组织、厚壁细胞为主，骨状石细胞还未分化出现；栅栏组织层较薄，规则的长矩形形状，排列紧密。在开花后第3 周，在栅栏组织下可见一层细胞形态发生变化，由圆形细胞向矩形状态转变，且排列变得紧密，骨状石细胞已开始分化；栅栏组织排列紧密，细胞形态开始变化，形状变得狭长。在开花后第4 周，已明显看出骨状石细胞的形态，细胞伸长，已具有骨状石细胞的形态；栅栏组织形态进一步细长变化。在接下来的第5 周，骨状石细胞形态发生变化，开始两端膨大，形成“工”字。之后随着种子的发育，骨状石细胞膨胀成型，细胞间隙增大，栅栏组织密度增加，排列紧密。

从图4 可以看出，随着种子的不断发育，种皮的厚度显著增加，在开花后第5 周时达到峰值，随着时间的推移，种子后期逐渐脱水成熟，种皮厚度降低，但逐渐趋于稳定。

由图5 可知，随着种子的发育，栅栏组织在种皮中所占的比例显著增加，在开花后第10 周即成熟时达到最高。

2.4 不同发育时期种脐解剖特征的比较

对不同发育时期的苦参种脐结构进行观察，结果如图6 所示，在种子发育的第2 周时，苦参种脐有珠柄残余物但中间还未形成凹陷，细胞聚积在一起已初现维管系统形态；第3 周时，珠柄残余物中间形成凹陷，排列致密的栅栏组织与其紧密相连；在第4 周时，种脐已发育完全，珠柄残余物、维管系统等结构已出现；在之后的发育过程中，种脐结构基本不再发生变化。说明在种子发育早期种脐结构已发育完全。

3 讨论

硬实性是一种常见的休眠方式，大部分的豆科植物都有硬实性。本研究对苦参的硬实性检测后发现，苦参具有很高的硬实性，6 个种源的硬实率高于93%。硬实性主要是由于种皮的不透性造成的，种皮的结构致密，表面有角质层或者蜡质沉积物，从而使得种子表皮不透水。对苦参种子进行石蜡切片后发现，苦参种子与大豆种子结构相似[20]，主要由种皮、种脐及子叶等结构组成，而种脐部位的珠孔与黄柏种子等相同，均由珠柄残余物等组成[21]。苦参种皮结构复杂，王书运等[22]在1993 年对几种豆科植物进行研究指出，豆科植物的种皮结构与禾本科相比更为复杂。研究苦参种皮解剖结构后发现，苦参种皮由角质层、栅栏组织、骨状石细胞、厚壁细胞以及薄壁细胞等组成[23]，种皮结构复杂，具有典型的豆科种皮结构特征。

角质层不透水、不透气，并且对胚存在机械阻碍作用，降低了种子的发芽率[24]。有一些学者认为，栅栏层是影响硬实的主要因素，如同在其他豆科植物中观察到的一致[25-27]，野生大豆种皮的栅栏层与栽培型大豆相比更厚[28]。姜华等[29]对田菁种皮结构与其渗透性之间的关系进行研究后发现，限制水分进入种皮的主要屏障是存在于种皮的栅栏层。徐亮等[30]用酸对野生大豆种子进行处理后发现，栅栏层结构基本保持完整以阻碍水分的吸收，说明栅栏层是引起种皮不透水的主要原因。

本研究对不同时期苦参种子的种皮结构进行研究后发现，随着种子的发育，种皮的厚度不断增加，栅栏组织在种皮中所占的比例逐渐增加。栅栏组织的结构致密，没有细胞间隙，从而增加了种皮的硬度，因此栅栏组织对种皮不透性具有重要的作用。角质层和栅栏组织排列非常致密，而骨状石细胞和厚壁细胞等随着种子的发育排列较为疏松。所以，苦参种子硬实不透水的主要原因可能是由角质层和栅栏组织造成的，但硬实性具体形成的分子机制还有待进一步研究。