不同肥料配比对黄芪有效成分合成关键酶基因表达的影响

陈家炜，梁 华，李文倩，张 莹，胡瑜辉，柴 智，赵建平，梁建萍

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西中医药大学黄芪资源产业化及产业国际化协同创新中心，山西晋中030619）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.Var.mongholicus（BSe.）Hsiao）或膜荚黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）的干燥根，其主要药效成分为黄酮、皂苷和多糖等[1]，具有补气固表、脱毒排脓、生肌等功效[2]。因黄芪药材需求量的不断增加，野生资源已远远不能满足需求，市场黄芪主要来自人工种植。就山西省而言，2015 年统计，黄芪人工种植面积约1.33 万hm2，传统鲜芪总产1 500 t，实现产值近5 000 万元[3-4]。但是，大量的市场需求和粗放的农业生产造成了市场上黄芪有效成分差异较大，产品质量无法保证。

诱导子是一类能通过选择性诱导特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径、提高植物次生代谢物含量的物质[5]。前期试验表明，15 μmol/L SA、15 mmol/L SNP、1.0 mg/L NAA 可以显著促进黄芪有效成分的积累，且SA 对黄酮效果最明显[6]。此外，从黄芪体内分离得到的固氮菌T16 和T21 可以有效促进黄芪幼苗的生长[7]。绿肥是一种可再生资源[8]，可以为植物提供全面的营养，特别是增加土壤氮、磷、钾含量，进而提高作物的产量和品质[9-10]。大量研究已经证明，合理施肥可以有效提高黄芪品质[11-13]，但是从分子水平解释施肥对黄芪有效成分积累影响的研究鲜有报道。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第1 步反应的关键酶和限速酶[14]，影响黄酮类化合物的生物合成[15]。查尔酮合酶（CHS）是黄酮化合物合成代谢途径中的第1 个限速酶[16]，它催化该途径的第1 步，即将小分子物质转化形成一个具有C15 架的黄酮类化合物查尔酮。该产物进一步衍生转化构成了各类黄酮化合物[15]。鲨烯合酶（SS）是三萜皂苷生物合成途径中第1 步，是催化法呢酯焦磷酸（FPP）缩合产生鲨烯（SQ）的关键酶[17]。大量研究表明，植物黄酮类化合物的累积与PAL、CHS 基因的表达水平密切相关，而SS 基因在植物皂苷类物质合成途径中起着极其重要的作用[18-23]。

本研究利用实时荧光定量PCR，从mRNA 转录水平定量检测PAL、CHS 和SS 这3 个基因在不同肥料（诱导子SA、SNP、NAA，固氮菌T16、T21，黄芪茎叶绿肥）配比处理下，黄芪根茎部位中的表达差异，从分子水平探讨不同肥料配比对黄芪有效成分合成积累的影响，旨在为黄芪人工栽培合理的水肥管理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用黄芪种子采自山西大同浑源黄芪药材基地。所用水杨酸（SA）、萘乙酸（NAA）和硝普钠（SNP）分别购自天津北辰方正、天大、天力化学试剂厂；固氮菌T16、T21 母液为前期试验获得；黄芪茎叶绿肥采自山西省大同市浑源县种植基地。

1.2 试验设计

黄芪种子先用H2SO4浸泡4 min，再用自来水冲洗，直至干净，轻微晾干后，分别用15 μmol/L 的SA、15 mmol/L 的SNP 和1.0 mg/L 的NAA 进行浸种处理。

表1 试验因素水平

2016 年4 月中旬整地、分区、施肥及人工播种。小区样地5 m×3 m，株距15 cm，行距25 cm，每小区需60 g 黄芪种子。采用4 因素3 水平正交试验设计，A 因素为诱导子的种类、B 因素为绿肥用量、C 因素为固氮菌T16 浓度、D 因素为固氮菌T21 浓度，因素水平列于表1，处理方案列于表2。

表2 处理方案

1.3 RNA 提取与反转录

使用北京百泰克生物技术有限公司的通用植物RNA 提取试剂盒（离心柱型）分别对样本的根、茎总RNA 进行提取。利用微量分光光度计检测RNA 的纯度，并通过琼脂凝胶电泳检测RNA 的完整性后，使用TAKARA BIO INC RR047A 试剂盒进行反转录。将反应体系5×gDNAEraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 6 μL，RNase Free dH2O 1 μL 在42 ℃下反应2 min 之后，迅速放在冰浴上；在原体系基础上，加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，并于37 ℃下反应15 min，再于85 ℃下反应5 s，之后冷却至4 ℃；用微量分光光度计检测cDNA 浓度后，用ddH2O 稀释至100 ng/μL，并于-20 ℃保存。

1.4 普通PCR

以反转录合成的cDNA 为模板，在常规PCR仪上进行梯度PCR，筛选引物和模板的最佳退火温度。在最佳退火温度下进行扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。反应体系为：10 μL 2×Master-Mix、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物、1 μL 模板、8 μL ddH2O，共20 μL。

1.5 实时荧光定量PCR

采用TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒，根据说明书建立20 μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，上下游引物混合共0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。每个样品重复检测3 次。PCR 反应采用2 步法，程序为：95 ℃初始变性10 min；95 ℃变性15 s，Tm ℃退火延伸1 min，重复40 个循环；循环结束后进行65～95 ℃的融解曲线分析。

1.6 数据分析

数据采用SPSS 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 RNA 提取

凝胶电泳图片显示（图1），提取RNA 条带清晰，结构完整，无拖尾现象；微量分光光度计检测OD260/OD280值，在1.8～2.0，表明无降解、无污染、纯度高。以上2 项检测说明提取的RNA 质量较高，可以使用。

2.2 引物及退火温度筛选

采用普通PCR 和荧光定量PCR 共同筛选引物。其中，普通PCR 仪设置退火温度梯度，反应完成，用琼脂糖凝胶电泳检测产物质量，初步筛选出目的条带较亮且引物二聚体较少的引物序列及合适的退火温度，再用荧光定量PCR 进一步筛选及检测。引物设计如表3 所示。

表3 引物序列

退火温度梯度设计为53.0，53.5，54.3，55.7，57.3，58.6，59.5，60.0 ℃，最终筛选出来的退火温度为57 ℃。

2.3 不同肥料配比对PAL 基因表达的影响

不同肥料处理后PAL 基因在黄芪根部的表达量不同（图2），处理6 和处理9 与对照相比显著提高，相对表达量分别是对照的2.1 倍和1.6 倍；其他各组与对照相比都表现为下降，其中，处理2、处理5 和处理8 下降超过50%，处理3 和处理7 下降较少，不超过10%。

从PAL 基因在茎部的表达量来看（图3），处理2、处理4 和处理6 相较于对照有所下降，其中，处理2 和处理6 下降较少，相对表达量分别下降6.05%和5.92%，处理4 下降最多，相对表达量下降了61.73%；其他各处理组合均高于空白对照，其中，处理1、处理5 明显高于对照，分别为对照的5.73 倍和5.83 倍。

2.4 不同肥料配比对CHS 基因表达的影响

从CHS 基因在根部的表达量来看（图4），处理4、处理6、处理7 以及处理9 均高于空白对照，其中，处理7 为对照的1.52 倍，处理6 最高，为对照的2.14 倍；其他处理组合均低于对照，其中，处理5、处理8 下降超过50%，相对表达量分别较对照下降64.07%和71.71%。

从CHS 基因在茎部的表达量来看（图5），处理3、处理4 和处理6 相较于对照有所下降，其中，处理6 下降最多，相对表达量下降65.25%；处理2 与对照相比，变化不明显；其他处理组合均比对照有明显增长，处理1 增长最明显，相对表达量为CK的7.19 倍，其余处理依次为处理5＞处理7＞处理9＞处理8。

2.5 不同肥料配比对SS 基因表达的影响

从SS 基因在根部的表达量来看（图6），处理2、处理5、处理6 和处理8 相对表达量较对照有所下降，其中，处理2、处理6 下降小于10%，分别为4.02%和8.54%，处理5 下降最多，下降了47.13%；其余处理相对表达量较对照均有所增加，其中，处理3 增长最多，为对照的18.44 倍；其余处理相对表达量大小依次为处理1＞处理7＞处理4＞处理9，分别为对照的6.79 倍、2.04 倍、1.70 倍和1.51 倍。

从SS 在茎部的表达量来看（图7），只有处理4和处理5 的相对表达量小于对照，其中，处理5 下降最明显，用本试验的检测方法几乎检测不到；其他各处理的相对表达量较对照均有所提高，处理1增加最明显，为对照的22.83 倍；处理2 和处理7 增长超过5 倍，分别为对照的6.06 倍、9.17 倍；其余处理依次为处理9＞处理8＞处理3＞处理6，分别为对照的2.76 倍、2.01 倍、1.85 倍和1.68 倍。

3 结论与讨论

PAL、CHS、SS 都是黄芪有效成分合成与积累的关键酶，它们的表达量影响着黄芪的品质及药用价值。有研究表明，平衡合理施肥是促进黄芪生长、增加产量及提高品质的重要栽培手段[24-25]。本研究结果表明，施入不同配比的肥料后，上述3 个基因的表达量与对照相比均有显著性差异。

在3 种对黄芪种子进行浸种处理的诱导子中，15 μmol/L 水杨酸对上述3 个基因在根、茎部位的表达量的影响最大。其中，水杨酸使黄酮合成关键酶基因PAL、CHS 在根部的相对表达量大幅减小，而茎部的相对表达量大幅增加，造成了这2 个基因在植物体不同部位的表达差异。杜研[26]、王景然等[27]研究表明，低浓度水杨酸能够有效促进黄芪愈伤组织和幼苗的总黄酮积累。结合本试验结果和已有研究成果，推测低浓度水杨酸是通过影响黄芪黄酮合成途径上关键基因在黄芪根、茎部位表达差异的方式而促进黄芪总黄酮的积累，但其具体机制还有待更深入的研究。

本研究结果表明，施入不同配比的肥料对黄芪次生代谢途径中的关键酶基因PAL、CHS、SS 表达有明显的影响，且在根、茎不同部位存在差异，这将会影响黄芪有效成分的合成与积累。至于这些基因如何调控黄芪有效成分的合成与积累，还有待于进一步探讨。