吕梁黑山羊成纤维细胞培养过程中霉菌污染的清除

吴苏君，王 曦，李 希，罗惠娣，毛杨毅，贺东昌，周胜花，李春艳，张 丽，郭慧慧，薛丽娜，党文庆

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

细胞培养作为一种体外增殖技术目前被广泛应用于教学、科研、临床实验、生物产品制备等领域，其虽然涉及因素繁多，但污染控制是其成功的关键。可能引发细胞发生污染的微生物有支原体、细菌、黑胶虫、霉菌等，其中，霉菌污染在雨季或潮湿环境中尤为常见[1]。

细胞被霉菌污染后，其生长速度、细胞形态、生长特性均会受到不同程度的影响[2]。在霉菌污染发生早期，培养液变化肉眼几乎不可见，倒置显微镜下观察可见细胞间有树枝状的菌丝悬浮在培养液中[3]；在霉菌污染发生后期，肉眼可见培养液中有圆饼状白色或浅黄色漂浮物，倒置显微镜下可见细胞间有纵横交错的菌丝，细胞生长分散、变圆漂起，脱落死亡[4]，这对细胞相关研究将产生严重影响。因此，发现细胞培养液被霉菌污染后应尽快清除。常见的霉菌清除方法有动物体内除菌法[5]、低速离心除菌法[6]、药物除菌法[7]等，这些方法各有优劣，本研究选用药物除菌法。

吕梁黑山羊是山西省优良的肉皮绒兼用地方品种，于1983 年被列入《山西省家畜家禽品种志》，是珍贵的畜种资源[8-9]。

本研究采集吕梁黑山羊耳部组织，体外培养耳源成纤维细胞[10-13]，添加不同浓度两性霉素B 对细胞培养液中霉菌进行清除，比较不同浓度药物的清除效果，进而构建稳定的细胞培养体系，以期为后续研究吕梁黑山羊的种质资源利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

吕梁黑山羊（0～3 月龄）耳缘组织采自山西省农业科学院畜牧兽医研究所克隆基地试验羊场。

胎牛血清FBS 购自Hyclone 公司；DMEM 购自Gibco 公司；DPBS、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、Hoechst 33342，均购自Sigma 公司；两性霉素B 溶液购自Biotopped 公司；其他试剂均为国产分析纯。24 孔板及细胞培养皿购自Thermo 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏 选择0～3 月龄的吕梁黑山羊，获取耳尖皮肤组织（1 cm2），4 h 内带回实验室。将组织块放入75%酒精中浸泡30 s 消毒，漂洗后剔除残留毛发和软骨组织剪成约1 mm2的小块，均匀接种于60 mm 培养皿中，倒置培养4～6 h，待组织块贴壁后，加入细胞培养液（DMEM＋1%双抗＋15%FBS）3～4 mL，每隔2 d 更换一次培养液，5～7 d 后观察组织块周围有无细胞迁出，待原代培养的单层细胞汇合度达到80%时，进行传代培养或冷冻保存。细胞汇合度达到80%时，弃去培养液，DPBS 洗涤3 遍，加入0.2%胰蛋白酶消化细胞，终止消化后收集细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清液。如需传代，加入细胞培养液重悬后均匀接种；如需冻存，加入预冷的冻存液（DMEM＋10%（V/V）DMSO＋15%（V/V）FBS，4 ℃保存）混匀，移入冻存管，在细胞程序降温盒中－80 ℃冰箱过夜，后移至液氮罐中长期保存。细胞复苏时，从液氮罐中取出冻存管，浸入37 ℃温水中快速解冻，待完全融化后移入15 mL 离心管中加入细胞培养液至10 mL，1 000 r/min 离心5 min；弃上清液，加入细胞培养液重悬细胞，接种至60 mm 细胞培养皿中，置于37 ℃的5%CO2饱和湿度培养箱中培养。次日更换培养液，待细胞汇合度达到80%时即可传代。

1.2.2 霉菌污染情况观察 肉眼及高倍显微镜下观察：疑为霉菌污染的细胞及对照组细胞在显微镜下直接观察，根据培养液及细胞形态学变化，对比判断有无污染。

1.2.3 霉菌污染后处理 疑为霉菌污染的细胞培养液中分别添加浓度为2.5，25，250 μg/mL 的两性霉素B。细胞每天洗涤3 遍后更换培养液，正常培养传代，在换液数小时后定时观察细胞及培养液情况，连续处理14 d。

1.2.4 细胞生长曲线的测定 两性霉素B 连续处理14 d 后，取霉菌污染消除且细胞恢复正常生长的试验组和对照组，待细胞汇合度达到80%时，消化细胞，1 000 r/min 离心5 min 后弃上清液，加细胞培养液重悬，以1×104个/孔接种至24 孔板中培养。每24 h 计数细胞，每次计数重复3 次，取平均值，连续计数7 d 后，根据时间和细胞密度绘制细胞生长曲线。

2 结果与分析

2.1 细胞原代、传代培养及冻存、复苏培养

通过组织块贴壁培养法成功分离出吕梁黑山羊耳缘组织成纤维细胞，培养5～6 d 即可观察到有细胞从组织块边缘向外迁出，培养10 d 后能清晰分辨出组织块周围有梭形且边缘立体的成纤维细胞。形态学观察可见细胞主要呈梭形、多角形或不规则形，细胞排列分散（图1-A）；细胞传代后生长状态良好，形态正常（图1-B）。

2.2 显微镜观察霉菌污染情况

疑为霉菌污染的细胞肉眼下可观察到浅黄色的漂浮物，呈薄蘑菇伞状，有中心，可随培养液晃动漂动，培养液有轻微浑浊；高倍显微镜下可观察到从中心发散开去的菌丝，细胞分布稀疏，生长速度显著降低，一些细胞变圆漂起，从皿底脱落。

2.3 药物处理后霉菌及细胞状态观察

表1 3 组浓度两性霉素B 处理霉菌污染的效果及细胞状态

当吕梁黑山羊细胞培养过程中发现霉菌污染时，对比不同浓度两性霉素B 处理霉菌污染的效果及细胞状态（表1）。由表1 可知，细胞培养液中两性霉素B 的添加质量浓度为2.5 μg/mL 时，无法抑制培养液中霉菌继续生长；两性霉素B 的添加质量浓度为250 μg/mL 时，细胞会大量死亡；两性霉素B 的添加质量浓度为25 μg/mL 时，既可抑制霉菌生长还可保持细胞活性，是发生霉菌污染时理想的使用浓度。

2.4 细胞生长曲线的绘制

选择细胞培养液中添加两性霉素B 质量浓度为25 μg/mL 的试验组和对照组绘制细胞生长曲线。根据细胞计数结果，以单位细胞密度为纵坐标、培养时间为横坐标绘制生长曲线，如图2 所示，试验组和对照组细胞生长曲线呈S 形分布，1～3 d 细胞处于适应期，生长缓慢；3～6 d 细胞处于指数生长期，生长旺盛；6～7 d 细胞处于平台期。试验组细胞增殖能力刚开始稍弱于对照组，说明细胞需要一段时间逐渐恢复，之后恢复正常生长，霉菌污染已被去除。

3 结论与讨论

细胞培养过程出现霉菌污染是常见且较难处理的问题。细胞被霉菌污染后，生长速度变慢，即使在不影响细胞存活率的条件下，霉菌产生的毒素也会破坏细胞DNA，对细胞造成损伤。有研究发现，在短时间低剂量作用条件下，霉菌毒素并不会诱导DNA 出现损伤，而作用时间延长则可通过增加细胞内活性氧含量造成氧化应激，进而对DNA 造成损失，才显示出其基因毒性，表明细胞对霉菌毒素有短期抵抗力。但霉菌毒素对动物机体的损伤比较明显，它会增加动物相关脏器质量和体质量、引发胃肠功能紊乱，导致腹泻、肝肿大和食欲减退[14-15]。细胞在霉菌污染后期，会由于毒性作用及营养耗尽而脱落死亡，对细胞相关研究产生严重影响。

通常情况下，细胞被霉菌污染后应直接灭菌丢弃，但若细胞来源有限、难以替代或者污染不严重，就需要采取措施清除霉菌污染。对比清除霉菌的不同方法清除霉菌污染，各有优缺点。杨卫兵等[6]用低速多次离心去除法清除霉菌污染，对细胞损伤低，所需试验条件简单，但对人员要求较高，试验中容易出现清除霉菌污染不彻底的现象。黄文敬等[16]在细胞培养基中加入适量的两性霉素B，可以有效降低脐带分离培养的污染率，且不影响脐带间充质干细胞的增殖和干性表达，但该试验只针对霉菌污染的预防，未涉及霉菌污染的清除。赵世祯等[17]采用多次洗涤细胞和连续传代的方法清除霉菌，简单有效，但耗时长。吴介恒等[2]在培养液中添加正常剂量5 倍浓度的双抗来清除早期的霉菌污染。田启超等[7]研究发现，在霉菌污染早期，细胞培养液中添加青霉素（100 IU/mL）、链霉素（100 IU/mL）、两性霉素（10 μg/mL），隔天换液，重复2～3 次，同时细胞培养箱用饱和硫酸铜清洁后用过氧乙酸熏蒸，可有效控制霉菌污染，但操作繁杂，仅适用于霉菌污染发生早期。本研究为不影响后续细胞研究，彻底清除霉菌污染，采用细胞培养液中添加抗生素的方法。

多烯大环内酯抗生素通过与细胞膜内的固醇相互作用，改变细胞渗透性造成细胞内容物外溢来发挥作用，对霉菌、丝状真菌等有很好的抑制作用，且毒副作用较低[18]。其中，制霉菌素与两性霉素B结构类似，对真菌的敏感性较好[19]。制霉菌素多被用于抑制念珠菌，两性霉素B 可广泛用于抑制隐球菌、球孢子菌、念珠菌、毛霉、曲菌等，且毒性反应较小[20]。由于霉菌种类鉴别耗时耗力，会延误挽救细胞的时机，故本研究选用抗真菌范围更广的两性霉素B 来清除细胞中的霉菌。黄文敬等[16]研究发现，将两性霉素B 作为一种抗真菌、抗酵母菌以及抗霉菌制剂加入细胞培养液中使用时，通常有效的质量浓度是25 mg/L，在30 mg/L 时有细胞毒性，会降低充质干细胞的细胞增殖能力，但不影响细胞整体的增殖能力。杨卫兵等[6]研究表明，两性霉素B 使用浓度过高可致细胞死亡，浓度过低时则不能抑制霉菌生长。故本研究在细胞培养液中添加两性霉素B时，设置3 组梯度浓度，结果显示，在细胞培养液中加入2.5 μg/mL 的两性霉素B，不能抑制霉菌生长，导致培养液随时间延长而浑浊，细胞大量死亡；而加入250 μg/mL 的两性霉素B 在抑制霉菌的同时还会导致细胞大量死亡，显微镜下可见大量细胞碎片，推测为两性霉素B 浓度太高，对细胞生长不利；而在细胞培养液中加入25 μg/mL 的两性霉素B，既可抑制霉菌生长还可保持细胞活性，是发生霉菌污染时理想的使用浓度。在细胞用两性霉素B 处理14 d 后，绘制细胞生长曲线，发现细胞的生长和增殖速度均恢复正常。说明吕梁黑山羊成纤维细胞中的霉菌污染已被彻底清除，无复感。本研究在细胞被霉菌污染时及时使用两性霉素B 对其进行清除，建立了一种细胞污染处理机制，在细胞培养实际工作中具有很高的操作性，实用性强，具有借鉴价值。

污染重在预防，在细胞培养过程中，要时刻警惕霉菌及其他污染，制定严格规范的细胞培养间日常管理消毒制度，定期对细胞、试剂、耗材、仪器进行污染检测，规范实验操作和记录流程，把污染的可能性降到最低，提高试验结果的稳定性和可靠性。