蜗牛匀浆液直肠给药对溃疡性结肠炎大鼠的保护作用

范志源 余秋雨 李欢 苏小娇 盛艳梅

[摘要] 目的 探讨蜗牛匀浆液直肠给药对溃疡性结肠炎大鼠是否具有保护作用。 方法 用冰醋酸诱导急性溃疡性结肠炎大鼠模型，将40只6～7周龄的SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法分为模型组、空白组、蜗牛匀浆液的高剂量组（1.0 g/kg）和低剂量组（0.5 g/kg），每组各10只。造模后，高、低剂量组连续直肠给予蜗牛匀浆液7 d，空白组与模型组均给予相同体积的生理盐水。每日观察大鼠的主要体征与粪便性状，同时计算体重变化并进行粪便评分。实验结束后，处死大鼠取目标结肠段，称量计算肠重系数，同时采用HE染色法进行病理组织检测。结果 与模型组比较，高剂量组和低剂量组大鼠体征明显改善，大鼠体重增加程度更显著（P < 0.05或P < 0.01），并且腸重系数显著降低（P < 0.01），高剂量组给药后第4天开始出现粪便评分显著下降（P < 0.05或P < 0.01）。同时，高剂量组炎性细胞浸润及炎症细胞浸润深度评分和溃疡深度评分与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 蜗牛匀浆液对溃疡性结肠炎模型大鼠可通过改善体征、增加体重、降低腹泻、对抗结肠组织水肿及炎性反应等产生较好的保护作用，尤以高剂量组作用明显。

[关键词] 蜗牛匀浆液;溃疡性结肠炎;直肠给药;保护作用

[中图分类号] R574.62          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（a）-0017-05

[Abstract] Objective To investigate whether snail homogenate has protective effect on ulcerative colitis in rats. Methods Rat model of acute Ulcerative Colitis induced by glacial acetic acid. Forty male Sprague-Dawley rats aged 6-7 weeks were randomly divided into model group， blank group， snail homogenate high （1.0 g/kg） and low （0.5 g/kg） dose groups according to random number table， with 10 rats in each group. After the model was completed， the high （1.0 g/kg） and low （0.5 g/kg） dose groups were given snail homogenate continuously for 7 days in the rectum， and the blank group and the model group were given the same volume of normal saline. The main signs and fecal traits of the rats were observed daily， and body weight changes were calculated and fecal scores were performed. At the end of the experiment， the rats were sacrificed and the target colon segment was taken. The coefficient of intestinal weight was calculated and the pathological tissue was detected by HE staining. Results Compared with model group， the symptoms in rats of high-dose group and low-dose group were significantly improved， the degree of weight gain of rats increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， and intestinal weighting coefficient reduced significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， a significant decrease in fecal scores of high-dose group began on day 4 after administration （P < 0.01）. Meanwhile， the scores of inflammatory cell infiltration depth and ulcer depth in the high-dose group were significantly different from those in the model group （P < 0.01）. Conclusion Snail homogenate can improve the physical signs， increase body weight， reduce diarrhea， and fight colonic hyperplasia and inflammatory reaction in rats with ulcerative colitis， especially at high doses.

[Key words] Snail homogenate; Ulcerative colitis; Rectal administration; Protective effect

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）主要表现为直肠与结肠黏膜的炎性溃疡性病变，严重可累及黏膜下层，临床表现为腹泻、腹痛、黏液便及血便等症状[1]。目前，UC治疗研究文献中中药和中西结合研究约占80%，应用较为广泛，且相对于化学药物，不良反应相对较少[2]，其中尤以中药直肠给药治疗起效较快，效果最为明显[3]。直肠可以使药物与溃疡面直接接触，持续高浓度作用于病灶，减少了炎症因子的渗出，取得了良好效果[4]。

中药蜗牛为巴蜗牛科巴蜗牛属动物同型巴蜗牛Bradybaena similaris（Ferussde）、华蜗牛属动物华蜗牛Cathaica fasciola（Draparnaud）及其同科近緣种的全体，《中药大辞典》载其“归膀胱、胃、大肠经。主治风热惊痫……痔疮，脱肛等”[5]。早在古代的西方医学中，使用碾碎的蜗牛应用于伤口[6]。蜗牛肉富含蛋白质、必需氨基酸和多不饱和脂肪酸等营养物质，并且蜗牛分泌的黏液中提取出的尿囊素可促进细胞再生，应用于烧烫伤[7]，黏液组分能促进胶原蛋白、弹性蛋白和真皮成分的形成，修复光老化，减少自由基造成的伤害[8-9]，并显示出较好的抗炎、促愈合作用[10-11]。因此，本实验拟采用含有蜗牛组织和黏液的匀浆液，对其直肠给药用于治疗UC的效果进行初步研究，以期为后续应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

蜗牛（自行捕捉，经鉴定为巴蜗牛科巴蜗牛属同型巴蜗牛）;冰乙酸（成都市科龙化工试剂厂，批号：2016041301），水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：20160316），乙醚（四川西陇化工有限公司，批号：20170524），甲醛溶液（成都市科龙化工试剂厂，批号：2016033102）;通用台式离心机（赛默飞世尔科技中国公司），分析天平（Sartorius，BP211D型），优谱超纯水器（成都超纯科技有限公司，UPH-1-20T型）等。

1.2 实验动物与分组

SPF级雄性SD大鼠40只，6～7周龄，体重180～220 g，购自四川成都达硕生物科技有限公司，动物许可证号[SCXK（川）2015-030]，分笼饲养，自由摄食饮水。根据随机数字表将实验动物分为空白组、模型组、高剂量组与低剂量组，每组10只，各组大鼠造模前禁食不禁水24 h，编号称重。

1.3 蜗牛匀浆液制备

取活体蜗牛洗净外壳后，禁食不禁水静养12 h排尽粪便。将活体蜗牛去壳后，取出蜗牛组织，称量，加入适量生理盐水，用手动匀浆仪研磨均匀[12]，加入不同体积生理盐水分别稀释成0.2、0.1 g/mL，即得含蜗牛匀浆液的高剂量组与低剂量组溶液备用。

1.4 动物模型建立与给药

将水合氯醛溶液（5%）按0.7 mL/100 g腹腔注射给予大鼠，待其麻醉后，经肛门注入冰乙酸（5%）1 mL，作用30 s后，用0.5 mL生理盐水灌洗1次[13]。低剂量组和高剂量组于造模后第2天，按照0.5 g/kg大鼠、1.0 g/kg大鼠分别直肠给予蜗牛匀浆液，模型组和空白组均给予相应体积生理盐水，1次/d，连续7 d。

1.5 大鼠体征的测定

每日观察大鼠精神状态、活动情况，记录大鼠造模前和实验结束时的体重，并计算体重变化。

1.6 粪便评分

参考文献[14]拟定粪便评分标准，每日记录各组大鼠粪便情况，给出相应评分，按粪便性状的程度：正常粪便、软粪便、非定型软粪便、水样粪便、血便分别记为0、1、2、3、4分。

1.7 肠重系数测定

给药完成后，采用脱颈椎法处死所有大鼠，解剖取出自肛门往上约7 cm肠段，在生理盐水中清洗，滤纸吸干表面水分后，统一剪取5 cm肠段称重，按照下述公式计算肠重系数：肠重系数=肠重/体重×100%。

1.8 结肠组织病理学检测

将取出的各组动物肠组织，固定于4 %甲醛溶液送检（成都里来生物医学实验中心）。步骤：依次进行脱水、包埋、切片、染色、封片后，在光镜4×10倍下观察大体组织、病变，再选择要观察的区域采集400倍图片，观察具体病变[15]。对各组结肠的炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度，按照溃疡性结肠炎症分级评分标准进行评分。见表1。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，非正态分布资料采用中位数（四分位数间距）[M（IQR）]进行描述。计量资料经t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料和非正态分布资料经秩和检验分析，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠体征及体重的影响

模型大鼠经蜗牛匀浆液高、低剂量组直肠给药后，食量、活动开始增加，精神状态也由萎靡状态逐渐好转。与空白组比较，模型组体重差值降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。蜗牛匀浆液直肠给药后，与模型组比较，高、低剂量组大鼠体重差值均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 对大鼠粪便性状的影响

冰醋酸造模后大鼠表现出明显腹泻，呈现水样粪便、稀溏或黏液稠密便，甚至血便，肛周毛发被粪便污染严重。模型组粪便评分高于空白组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。给药后，高、低剂量组腹泻症状逐渐减轻，由水样型稀便转为松散型软粪便，从第4天开始，高剂量组的粪便评分低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.3 对大鼠肠重系数的影响

与模型组比较，空白组、高剂量组和低剂量组的肠重系数均降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表4。

2.4 对大鼠结肠组织炎症的影响

用400倍光学显微镜观察，与模型组比较，高、低剂量组的结肠组织黏膜单层柱状上皮、固有层及黏膜层结构相对清晰和完整，少见变性及坏死，炎症细胞浸润深度较浅。见图1。另外，采用Kruskal-Wallis H检验，各组炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度评分的分布不同，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表5。同时，采用Bonferroni法矫正显著性水平后两两比较，模型组在炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度评分的分布与空白组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;高剂量组的炎症细胞浸润深度评分与溃疡深度评分的分布与模型组比较，差异有统计学意義（P < 0.05）。见表6。

3 讨论

现代研究表明中药蜗牛黏液已显示出较好的抗炎、促愈合作用等，如：蜗牛组织匀浆液中提取的粗蛋白对于多种致病菌和真菌显示出较高的抗微生物活性[16];蜗牛的黏液中存在多种复杂并未充分表征且不能被实验室所合成的活性天然产物[17]，在黑色素瘤的体外研究中表现出较好的抗肿瘤活性[18];另外在对黏液的粗制纯化提取物进行哺乳动物成纤维细胞定居的伤口愈合体外实验中，发现其对成纤维细胞具有促存活、增殖与迁移作用，诱导IL-8的分泌，促进伤口愈合[19-20]。同时，研究[3]表明溃疡性结肠炎的现代临床治疗采用中药特别是中药直肠给药较西药更具综合优势。

鉴于此，本研究创新性地将蜗牛匀浆液直肠给药治疗UC模型大鼠，通过对其各项体征的观察及粪便性状、体重、肠重系数、结肠组织炎症等指标的分析，发现蜗牛匀浆液可以改善模型大鼠活动，使其食量增加、精神状态好转等，并且能够改善大鼠粪便性状，降低腹泻评分;同时，蜗牛匀浆液可以通过减少结肠炎病理损伤程度来降低肠重系数和结肠炎症评分，有效控制溃疡恶化累及至结肠黏膜下层，且以高剂量组作用突出，该研究结果提示，蜗牛匀浆液直肠给药对于UC大鼠确有较好的保护作用。

本实验在蜗牛匀浆液的处理方法中，对鲜蜗牛静养排便、去壳去杂、低温保存、低温匀浆等环节进行控制，确保受试样品的活性与实验操作的可靠性。尽管结果提示采用该法制备的蜗牛匀浆液确实显示出良好的抗UC大鼠结直肠炎症损伤作用，但蜗牛匀浆液同样具备中药组成成分复杂这一共性，其用于抗炎作用的物质基础目前还不明确，可能的作用机制也不清楚。课题组将在此基础上，进一步对蜗牛匀浆液进行活性成分研究，以揭示其治疗UC的物质基础与可能机制，以期深入开发挖掘蜗牛的临床应用价值。

[参考文献]

[1]  王丽梅，相祎，吴颖，等.甘露聚糖肽联合美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎的临床效果[J].中国医药导报，2018，15（33）：89-92.

[2]  秦菲，叶柏.中西医结合治疗溃疡性结肠炎的研究进展[J].中医药导报，2015，21（14）：99-101.

[3]  胡倩，罗怀岗，李五生.中药灌肠对溃疡性结肠炎的治疗进展[J].临床合理用药杂志，2016，9（4）：167-168.

[4]  李晓玲.美沙拉秦不同给药途径治疗活动期溃疡性结肠炎的疗效及对血清炎性因子的影响[J].河北医学，2016， 22（10）：1595-1597.

[5]  南京中医药大学.中药大辞典[M].2版.上海：上海科学技术出版社，2006：3477-3479.

[6]  Bonnemain B. Helix and Drugs：Snails for Western Health Care From Antiquity to the Present [J]. Evid Based Complement Alterna Med，2005，2（1）：25-28.

[7]  Tsoutsos D，Kakagia D，Tamparopoulos K. The efficacy of Helix aspersa Müller extract in the healing of partial thickness burns：A novel treatment for open burn management protocols [J]. J Dermatological Treatment，2009，20（4）：219-222.

[8]  Brieva A，Philips N，Tejedor R，et al. Molecular Basis for the Regenerative Properties of a Secretion of the Mollusk Cryptomphalus aspersa [J]. Skin Pharmacol Physiol，2008， 21（1）：15-22.

[9]  Sallam AAA，El-massry SA，Nasr IN. Chemical analysis of mucus from certain land snails under Egyptian conditions [J]. Archives Phytopathol Plant Protect，2009，42（9）：874-881.

[10]  Mubarak MASE，Lamari FN，Kontoyannis C. Simultaneous determination of allantoin and glycolic acid in snail mucus and cosmetic creams with high performance liquid chromatography and ultraviolet detection [J]. J Chromatography A，2013，1322（24）：49-53.

[11]  Dimosthenis T，Despoina K，Konstantinos T. The efficacy of Helix aspersa Müller extract in the healing of partial thickness burns：a novel treatment for open burn management protocols [J]. J Dermatological Treatment，2009， 20（4）：219-222.

[12]  Ziomek M，Drozd A，Cha？覥abis-mazurek A，et al. Concentration levels of cadmium and lead in the raw and processed meat of Helix pomatia snails [J]. Pol J Vet Sci，2018，21（3）：483-489.

[13]  Pandey A，Verma S，Kumar VL. Metformin maintains mucosal integrity in experimental model of colitis by inhibiting oxidative stress and pro-inflammatory signaling [J]. Biomed Pharmacother，2017，94：1121-1128.

[14]  母小东，韩玉梅，邹丽.参肠片治疗溃疡性结肠炎的实验研究[J].西南军医，2009（2）：235-237.

[15]  陈怀涛.兽医病理学原色图谱[M].中国农业出版社，2008：694.

[16]  Ulagesan S，Kim H. Antibacterial and Antifungal Activities of Proteins Extracted from Seven Different Snails [J]. Appl Sci，2018，8（8）：1362.

[17]  Greistorfer S，Klepal W，Cyran N，et al. Snail mucus-glandular origin and composition in Helix pomatia [J]. Zoology，2017，122：126-138.

[18]  Ellijimi C，Ben HM，Othman H，et al. Helix aspersa maxima mucus exhibits antimelanogenic and antitumoral effects against melanoma cells [J]. Biomed Pharmacother，2018，101：871-880.

[19]  Trapella C，Rizzo R，Gallo S，et al. HelixComplex snail mucus exhibits pro-survival，proliferative and pro-migration effects on mammalian fibroblasts [J]. Sci Rep，2018，（8）：1-10.

[20]  Bortolotti D，Trapella C，Bernardi T，et al. Letter to the Editor：Antimicrobial properties of mucus from the brown garden snail Helix aspersa [J]. Br J Biomed Sci，2016，73（1）：49-50.

（收稿日期：2019-01-13  本文編辑：封   华）