一种基于N基因的麻疹病毒实时荧光RT-PCR检测技术

文奇 ，付倩 ，宋利军 ，刘琴 ，周郡 ，张艳妮

(1.新余市疾病预防控制中心，江西 新余 338000；2.江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

目前麻疹病例的实验室诊断方法有：急性期血清中检出麻疹IgM抗体，恢复期相比急性期血清中麻疹IgG抗体阳转或滴度呈4倍以上增高，鼻咽拭子或尿液中分离到麻疹病毒或检出麻疹核酸[1]。ELISA法检测麻疹IgM抗体和RT-PCR方法检测麻疹核酸因具有操作简便、快速等优点被国内外实验室普遍采用。然而免疫功能低下的患者或在发病初期，尤其发病1～3d内血清IgM抗体滴度低致使阳性检出率不高，病例诊断单纯依赖IgM抗体结果不免带来一定的漏检[2，3]。RT-PCR检测可以克服IgM抗体检测的不足之处，已成为实验室诊断的重要补充手段[4]。如今该技术发展到更高阶段的实时荧光RT-PCR获得越来越多人的青睐，许多商品化荧光RT-PCR试剂盒不断被研发上市。本文拟引进一种以麻疹病毒N基因片段为检测目标的荧光RT-PCR技术，通过与国产知名的荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒对比检测2014年新余市所收集的麻疹疑似病例样本，对其技术性能进行评估分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 按照 《全国麻疹监测方案（2009版）》要求，县、区CDC工作人员对辖区内2014年出现的麻疹暴发疫情或散发的就诊疑似病例，采集出疹前、后5日内的鼻咽拭子置于北京友康生产的病毒运送培养基（VTM），同时采集出疹后28d内的静脉血分离出血清，所有样本于冷藏条件下运送至市CDC麻疹实验室，不能及时送检的样本冷冻保存。

1.2 病毒RNA提取 根据Qiagen公司的RNeasy Mini Kit 试 剂 盒 （Cat.No：74106，Lot No：145022097）说明书提取咽拭子样本中的病毒RNA。

1.3 国产某荧光RT-PCR试剂盒检测麻疹病毒核酸 按照该公司生产的麻疹病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法，Cat.No：BN238）说明书配备反应体系和扩增条件。反应液A(内含引物与探针)17μl，反应液 B（混合酶）3μl，RNA 提取物 5μl；逆转录 50℃ 15min；预热 95℃ 15min；变性 94℃ 15s，扩增55℃ 45s（FAM通道收集信号），40个循环，在ABI7300仪器（下同）上进行扩增。

1.4 荧光RT-PCR技术检测麻疹病毒N基因 利用ABI公司的AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit（Cat No：AM1005）试剂盒进行反应体系配制，总体积为 25μl。 反应条件参照有关文献[5，6]：46℃逆转录 10min，95℃预变性 10min，95℃变性15s，60℃延伸45s，共45个循环。N基因扩增选用Kimberly设计的引物和探针[7]，具体序列如下，MV-N3（1139-1160F）：5′-TGGCATCTGAACTCGGTATCAC-3′，MV-N3（1213-1190R）：5′-TGTCCTCAGTAGTATG CATTGCAA-3′，MV-N3 （1163-1187P）：5′-(FAM)CCGAGGATGCAAGGCTTGTTTCAGA-3′(BHQ1)，引物与探针委托上海sagon生物工程股份有限公司合成。

1.5 ELISA法检测麻疹病毒IgM抗体 采用珠海海泰公司的麻疹病毒IgM抗体检测试剂盒（ELISA捕获法，Lot No：20140121）对患者血清进行检测，经酶标仪Anthos 2010读取单波长A450nm值判断结果。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种荧光RT-PCR检测结果分析 在47例麻疹疑似病例咽拭子样本中，经2种荧光RT-PCR检测结果均为阳性、阴性的样本数分别为11例、35例，经国产某RT-PCR试剂盒检测为阴性而拟引进RT-PCR检测为阳性的样本数只有1例。两种荧光RT-PCR方法的阳性率分别为23.4%（11/47）、25.53%（12/47），差异无统计学意义，两法总符合率为 97.87%（（11+35）/47），见表 1。

表1 麻疹疑似病例咽拭子2种荧光RT-PCR检测结果分析

2.2 ELISA法与拟引进荧光RT-PCR检测结果分析 47例麻疹疑似病例依次经ELISA检测血清IgM抗体和拟引进荧光RT-PCR检测咽拭子N基因，检测结果均为阳性、阴性的病例数分别为8例、35例，ELISA检测结果为阴性而新荧光RTPCR检测为阳性的病例数为4例。ELISA法与新RT-PCR法的检测阳性率分别为17.02%（8/47）、25.53%（12/47），两种方法检测阳性率之间比较差异具有统计学意义（χ2=28.12，P＜0.005），总符合率为 91.49%（（8+35）/47），见表 2。

表2 麻疹疑似病例血清IgM抗体、咽拭子N基因检测结果分析

3 讨论

麻疹病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，主要有6个结构基因，分别编码核蛋白（N）、基质蛋白（M）、血凝素蛋白（H）、融合蛋白（F）、磷蛋白和多聚酶，其中H、N基因变异最大[8]。根据H、N基因的序列特征，麻疹病毒被划分为8个基因组和24个基因型[9-11]。文献报道出来的有关检测麻疹病毒荧光RT-PCR技术中，用以检测的目标片段可以选取H或N基因上的序列，也可以是来源于F或M基因的[12-16]。Kimberly等人在研发以麻疹病毒H、N和F基因分别作为检测目标的实时荧光RT-PCR方法中发现：相比于常规RT-PCR，这些荧光RT-PCR法在维持高水平的特异性和结果重复性的同时，具有更低的检测下限，可达到10拷贝数/反应；并且在模拟检测合成RNA时检测H、F基因的荧光RT-PCR显示出相同或更强的敏感性，在检测临床样本时针对N基因的检测方法反而具有最高的敏感性[7]。造成这种相背离现象的原因在于：在麻疹病毒感染细胞中，三者中N基因的mRNA是最为丰富的转录本，转录梯度为N＞F＞H[17]。

尽管血清学检测在基层实验室得到了广泛应用，其中检测麻疹患者出疹后3～28d IgM抗体的ELISA方法拥有83～89%的灵敏度和95～100%的特异度[18]，但其局限性仍不可忽视。当出疹后过早地采集血清或检测过程中IgG抗体分离不完全时可能引起假阴性结果；当血清中存在类风湿因子或者风疹、B19等病毒IgM抗体的干扰时可能造成假阳性结果[19]。在麻疹低流行区甄别散发病例，血清检测结果出现难以下结论而不大可能采集到患者第二份（间隔数日）血样的情况下，荧光RT-PCR技术不仅对血样，还可以对鼻咽拭子、尿液、唾液等其他样本进行核酸检测，借以明确诊断。

本实验室经江西省疾控中心疾检所推荐，引进一种检测麻疹病毒N基因的荧光RT-PCR新技术，它包含的一套特定引物和探针，现已被纳入到最新版的麻疹诊断标准（WS296-2017）。通过与国产某荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒对比验证得知，在检测阳性率（敏感性）方面，新荧光RT-PCR法和国产荧光RT-PCR试剂盒较高，ELISA法较低，其中两种荧光RT-PCR方法之间的符合率非常高 (约为98%)。新荧光RTPCR技术的引入和运用，将有助于提高新余市麻疹实验室的监测技术水平，增强麻疹散发病例、不典型病例的发现力度，对本地区麻疹控制和消除工作具有重要意义。