ST悬浮细胞系的驯化与猪细小病毒的培养

赵 刚，闫 冰，刘鑫莹

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150000）

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞及病毒

ST细胞（哈药集团生物疫苗有限公司保存和提供）；病毒（由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定和保存）。

1.1.2 试验试剂

新生牛血请（购自内蒙古金源康生物工程有限公司）；MEM 培养基（购自美国Gibco 公司）；Virus Pro®ST-S无血清培养基（购自上海源培生物科技有限公司）；胰蛋白酶（购自美国Sigma 公司）；0.5%豚鼠红细胞悬液（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制）。

1.2 试验方法

1.2.1 ST细胞低浓度血清适应及驯化

采用逐步降低血清的方法驯化ST 细胞以适应低浓度血清培养，在含10%新生牛血清的MEM 培养液中稳定生长的ST 细胞长至对数生长中期时，更换为含5%新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80%～90%的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105个·mL-1传代于含5%新生牛血清的MEM培养液中。经过5代后，ST细胞在含5%新生牛血清的MEM 培养液中的存活率维持在95%以上，并保持正常贴壁性能和较快生长速率，可进一步降低血清驯化培养。以同样的方法使ST 细胞逐步适应含1%新生牛血清的MEM培养条件。

1.2.2 悬浮生长ST-S细胞株筛选

以适应1%新生牛血清条件的ST细胞为出发点，在三角培养瓶中进行悬浮培养驯化适应，培养液为1%新生牛血清的ST-S无血清培养基，细胞初始接种密度为5.0×105个·mL-1，培养转速为160 r·min-1。每天取样检测细胞密度，从中选出生长旺盛的细胞扩繁保种，命名为ST-S细胞株。

1.2.3 病毒含量测定

将病毒液用MEM 细胞培养液作10 倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，各加入96孔细胞培养板，每个稀释度6 孔，每孔100 μL，同设6孔加100 μL MEM作为无病毒空白对照。每孔加入100 μL新消化的ST细胞悬液（4.0×105个·mL-1），置37 ℃，5%CO2培养箱中培养5 d，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，取最高细胞病变时间点，按Reed-Muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度（TCID50）。

1.2.4 生物反应器培养猪细小病毒

将ST-S 细胞以初始密度0.75×106个·mL-1接种至生物反应器，上罐后培养12h，按照MOI（病毒感染复数）0.1的比例接种猪细小病毒L株，接种后72 h 收获。于7 L 生物反应器中连续培养3 批，测定猪细小病毒L株的病毒含量和红细胞凝集价。

2 试验结果

2.1 ST细胞低浓度血清适应及驯化

经低血清被动悬浮培养适应，ST 细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，细胞个体大小基本均一，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在低血清悬浮培养驯化后期，悬浮ST-S 细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明ST-S 细胞已经适应了低血清营养条件，成为单细胞悬浮状态生长，见图1、2。ST-S细胞不同时间细胞生长密度见表1。

由表1可知，ST-S细胞最高生长密度可达4.5×106个·mL-1。将该悬浮驯化好的ST-S细胞扩大培养确定为F0代。

2.2 悬浮ST-S细胞增殖猪细小病毒

将ST-S 细胞以初始密度0.75×106个·mL-1接种至生物反应器，上罐后培养12h，按照MOI（病毒感染复数）0.1的比例接种猪细小病毒L株，接种后72 h 收获。于7 L 生物反应器中连续培养3 批，测定猪细小病毒L株的病毒含量和红细胞凝集价。结果表明，工艺参数稳定性较好，病毒含量可稳定在107.36～107.60TCID50·mL-1，红细胞凝集价在1∶512～1 024，结果见表2。

图2 ST-S细胞悬浮培养后期

表1 ST-S细胞不同时间细胞生长密度

表2 悬浮ST-S细胞增殖猪细小病毒

3 讨 论

试验中采用逐步降低血清含量并调整无血清培养基配方的方法，最终可获得无血清悬浮培养的ST细胞，此株ST细胞可以稳定连续传代，细胞生长可以维持在较高的活力及细胞密度，从摇瓶放大至7L 反应器，细胞生长稳定。本研究掌握了一种ST 悬浮细胞驯化的方法，其他贴壁细胞的驯化也可借鉴此类方法。

经悬浮驯化的ST-S 细胞对猪细小病毒敏感，病毒在其上的增殖能力与转瓶培养相当，可获得较高的病毒滴度及红细胞血凝价；转瓶培养猪细小病毒的操作过程繁琐、同一批次不同细胞瓶中病毒的滴度也存在差异、时间成本大。利用ST 悬浮细胞生产的病毒产量远远高于贴壁培养，且同一批次的病毒质量更均一稳定，为后续逐级放大奠定基础。

4 结 论

本文所述方法驯化的ST 悬浮细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，生长速度正常，细胞最高生长密度可达4.5×106个·mL-1，以此为基础制备猪细小病毒可规模化快速大量生产，易于质量控制，纯度高，稳定性好，病毒含量可稳定在107.36～107.60TCID50·mL-1，红细胞凝集价在1∶512～1 024。因此生产工艺可用于猪细小病毒的大规模生产。