外源一氧化氮对铬胁迫下娃娃菜种子萌发及幼苗生理特性的影响

闫志强，陈银萍，余沛东，师小平，颉海帆，丁浚刚

(兰州交通大学环境与市政工程学院，甘肃 兰州 730070)

【研究意义】铬(Cr)的毒性与其存在的价态有关，在生态环境中，Cr(Ⅵ)比Cr(Ⅲ)毒性高100倍，相比于Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅵ)具有化学活性强、移动性大、生物毒性强且持久，易被植物吸收等特点，不仅能在作物体内残留，影响作物的正常生长，导致粮食减产[1-3]，而且还能通过食物链进入人体从而危害人类健康[4]。近年来，随着工业化的迅速发展，Cr在工农业中得到了广泛的应用，但由于大量的含Cr“三废”不合理的排放，导致土壤受Cr严重污染，生态环境急剧恶化[5]。因此，土壤Cr污染的治理已迫在眉睫。【前人研究进展】一氧化氮(Nitric oxide, NO)是植物体中一种氧化还原信号分子，参与调节植物各种生理过程，具有保护细胞和缓解毒害的双重效用[6]，适量的NO能够作为抗氧化剂，通过清除活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)并诱导抗氧化酶基因的表达，来增强植物对逆境胁迫的抗性[7-8]。有研究表明，NO也参与植物对各种重金属胁迫的信号应答[9]。硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)作为一种外源NO供体能减轻Cd、Pb胁迫对羽扇豆(Lupinusmicranthus)根生长的抑制作用[10]，提高水稻(Oryzasativa)对Cd[11]和甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)对Mn[12]的耐受性，缓解重金属对其的毒害作用。【本研究切入点】娃娃菜(Brassicapekinensis)具有口感嫩脆、高产、抗病、适应性广、耐贮运等优良特性，是国内在高海拔灌溉农业区生产优质蔬菜[13]，特别是当我国长江以南地区在6-9月蔬菜产量低时，能够高产供应以缓解其困境。我国关于娃娃菜的研究多数集中在优化高产栽培技术和防治病虫害方面上[14-15]，鲜有关于Cr污染对娃娃菜的生长发育影响的报道，而关于NO对Cr抑制娃娃菜生长发育的研究更为少见。【拟解决的关键问题】本实验以娃娃菜为实验材料，采用不同浓度的SNP对Cr胁迫下娃娃菜种子及幼苗进行处理，分析外源NO对Cr胁迫下娃娃菜种子萌发和幼苗膜脂过氧化、渗透调节物质和抗氧化酶活性的影响，旨在探索调节外源NO水平对缓解Cr胁迫下娃娃菜萌发生长的作用机理，以期为深入研究缓解Cr对作物毒害方面提供一定的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料为购于甘肃省农科院的‘韩国二号娃娃菜’。NO供体硝普钠(亚硝基铁氰化钠，sodium nitroprusside，SNP，购自 Sigma 公司)，现用现配，通常0.15 μmol·L-1SNP可以产生小于0.2 μmol·L-1的NO[16]。配置Hoagland营养液为母液。

1.2 实验设计

1.2.1 发芽试验 选取籽粒饱满整齐一致且无病虫伤害的种子洗净种外包衣，用质量分数为1 %的NaClO消毒10 min，然后再用蒸馏水冲洗数次，吸干种子表面水分后播于铺有一层滤纸的培养皿中，每个培养皿中摆放35颗。以Hoagland营养液为母液，设置6个实验组，均施加50 μmol·L-1的K2Cr2O7模拟Cr胁迫，每组分别施加 0、50、100、200、500、1000 μmol·L-1的SNP(Cr，Cr+50，Cr+100，Cr+200，Cr+500，Cr+1000)，以Cr0+SNP0为空白对照组(CK)组，共7组每组3个重复。然后在温度为25 ℃，光照时间12 h/d的培养箱内培养，每天定时加处理液并更换滤纸，连续培养7 d，每24 h观察发芽数。第8天时，以芽长超过1 mm为发芽标准，计算发芽率、发芽势，发芽指数，并测其胚根长和胚芽长，胚芽鲜重，胚根鲜重，胚芽干重，胚根干重。

1.2.2 盆栽试验 将营养土，沙子，黄土以1∶1∶1的比例混合，装入直径为15 cm的花盆中，每个盆中装入1.5 kg，然后将冲洗干净的种子均匀地洒在花盆中，每个盆中大约50颗左右，定期浇水，1周后设置7组实验组(CK，Cr，Cr+50，Cr+100，Cr+200，Cr+500，Cr+1000)，每组设3个重复，连续处理7 d。待幼苗3片真叶完全展平时，取叶片测定叶绿素(Chl)含量，丙二醛(MDA)含量，游离脯氨酸(Pro)含量，过氧化氢酶(CAT)活性，超氧化物酶(SOD)活性以及电导率(REC)。

1.3 测试方法

1.3.1 发芽率测定 以芽长超过1 mm为发芽标准，以根数发出3个以上为发根标准，并测其培根长和胚芽长。每天记录发芽数，发根数，并计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。

发芽率=培养结束时种子萌发数÷供试种子数×100 %

发芽势=培养第4天时种子萌发数÷供试种子数×100 %

发芽指数=∑(第n天种子净萌发数/萌发天数)

活力指数=第n天胚根及胚轴的总长度×发芽指数

1.3.2 生理生化指标的测定 采用丙酮提取液法测定叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素(Car)的含量[17]，硫代巴比妥酸法测定MDA含量[18]，酸性茚三酮比色法测定游离Pro含量[17]；硫代巴比妥酸法测定CAT活性[19]，氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活性[20]，电导率仪法测定REC[18]。

1.4 数据处理

应用Excel 2007 进行数据分析计算；SPSS22.0软件进行单因素方差检验和最小显著性差异法检验，显著性水平为α=0.05；用OriginPro 9.0作图。

表1 不同浓度SNP对Cr胁迫下娃娃菜种子萌发的影响

注：同列中不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。下同

Note: Different capital letters in the same column meant significant difference at 0.05 level. The same as below.

2 结果与分析

2.1 外源NO对Cr胁迫下娃娃菜种子萌发的影响

Cr胁迫下娃娃菜种子的发芽率、发芽势和活力指数与CK相比显著降低，分别降低了15.8 %、18.7 %和27.1 %，发芽指数与CK对比也降低了12.1 %(P<0.05)，说明Cr胁迫下娃娃菜种子的萌发受到了抑制。使用不同浓度SNP处理Cr胁迫下娃娃菜种子，随SNP浓度的增加，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数的整体趋势表现为先升高后降低。与Cr胁迫下种子萌发情况相比，SNP浓度为200 μmol·L-1时发芽率、发芽势和活力指数显著升高，分别升高了14.1 %、21.8 %和29 %(P<0.05)，而发芽指数高了7.8 %。但是，当SNP浓度继续升高时，娃娃菜种子的发芽率、发芽势和发芽指数开始显著降低(表1)。单因素方差分析可知，Cr与SNP均能对娃娃菜种子的萌发产生显著的影响，而一定浓度的SNP能缓解Cr对娃娃菜种子萌发的抑制作用，其中在SNP浓度为200 μmol·L-1时，缓解效果最为显著。

2.2 外源NO对Cr胁迫下娃娃菜幼苗生长的影响

50 μmol·L-1Cr胁迫使娃娃菜幼苗的胚芽和胚根的长度、鲜重与干重对比CK均显著降低(P<0.05)，分别降低了25 %和33.5 %、27 %和3.1 %与4.4 %和3.2 %。不同浓度SNP处理均能促进Cr胁迫下娃娃菜幼苗的生长，当SNP浓度为200 μmol·L-1时，幼苗的胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚芽干重和胚根干重均有显著升高(P<0.05)，对比Cr胁迫下未加SNP的处理组分别提高了31.5 %、35.6 %、35 %、4.4 %和2.2 %(表2)。但随着SNP浓度的升高，对幼苗生长的促进效果开始减缓。单因素方差分析显示，一定浓度的SNP能够缓解Cr对幼苗的胁迫作用，当SNP浓度为200 μmol·L-1时，缓解胁迫的效果最为显著。

2.3 外源NO对Cr胁迫下娃娃菜幼苗生理特性的影响

2.3.1 SNP对Cr胁迫下娃娃菜幼苗叶片叶绿素含量的影响 与CK相比，Cr胁迫下娃娃菜中Chla、Chlb、Car和Chl总量显著降低(P<0.05)，分别降低了14.6 %、12.0 %、14.0 %和10.1 %。施加不同浓度SNP能增加Chl含量，其中当SNP浓度为200 μmol·L-1时，较Cr胁迫下未施加SNP处理组Chla、Chlb、Car和Chl总量分别增加了36.3 %、30.2 %、29.3 %和34.8 %(P<0.05)。随SNP浓度进一步增加Chl含量不再增加，反而开始呈现下降的趋势，但仍高于Cr胁迫下未施加SNP处理组，表明添加不同浓度SNP均能增加Cr胁迫下娃娃菜幼苗Chl含量，其中SNP浓度为200 μmol·L-1时Chl含量增加最显著(图1)。

表2 不同浓度SNP对Cr胁迫下娃娃菜幼苗生长的影响

图1 不同浓度SNP对Cr胁迫下娃娃菜幼苗叶绿素含量的影响

2.3.2 外源NO对Cd胁迫下娃娃菜幼苗叶片MDA含量和REC的影响 Cr胁迫下，娃娃菜幼苗的MDA含量和REC均显著增加(P<0.05)，对比CK分别增加了136.0 %和122.4 %。施加不同浓度SNP均可不同程度地降低MDA含量和REC，其中，当SNP浓度为200 μmol·L-1时，降低效果最显著(P<0.05)，相比Cr胁迫下未施加SNP处理组分别降低了49.7 %和34.4 %。但是，当SNP浓度继续增加时，MDA含量与REC反而开始呈现增加趋势(图2)。

2.3.3 外源NO对Cd胁迫下娃娃菜幼苗叶片SOD和CAT活性的影响 Cr胁迫下娃娃菜幼苗中抗氧化酶活性均有升高，但与CK相比并无显著性变化(P>0.05)。施加不同浓度SNP均能增加SOD和CAT活性，其中，200 μmol·L-1SNP能显著提高SOD和CAT活性(P<0.05)，对比Cr胁迫下未施加SNP的处理组分别升高了25.6 %和64.9 %。但是，随着SNP浓度的进一步升高，SOD与CAT活性呈现出降低的趋势(图3)。

2.3.4 外源NO对Cr胁迫下娃娃菜幼苗叶片渗透Pro含量的影响 Cr胁迫下娃娃菜幼苗中的Pro含量有所增加，但对比CK增加不显著(P>0.05)。施加不同浓度SNP后，Pro含量均有增加，其中施加200 μmol·L-1SNP使Pro含量增加最显著，对比Cr胁迫而未施加SNP的处理组，增加了118.5 %(P<0.05)，而随着SNP浓度的增加， Pro含量呈现降低的趋势(图4)。

图2 不同浓度SNP对Cr胁迫下娃娃菜幼苗叶片MDA含量(A)和REC(B)的影响

图3 不同浓度SNP对Cr胁迫下娃娃菜幼苗叶片SOD(A)和CAT(B)活性的影响

图4 NO对Cd胁迫下娃娃菜幼苗叶片Pro含量的影响

3 讨 论

Cr(Ⅵ)作为工业的五毒之一，是一种毒性较大的致畸、致突变剂[21]，对动植物的生长发育有极强的伤害。高浓度Cr抑制植物根细胞分化，阻碍水分吸收，从而导致植株矮小，叶片泛黄，叶面积明显减少，生物量降低，对植物产生毒害作用；低浓度Cr促进根、根毛生长，增加根中髓质和外皮组织层的比例，促进植物的生长[22-23]。本实验中发现，土壤中加入外源Cr后，娃娃菜种子的萌发和幼苗生长受到了显著的抑制，幼苗叶片Chl含量降低，影响光合作用，进一步影响幼苗的生长发育，MDA含量和REC均升高，说明Cr胁迫造成了膜脂过氧化加剧，对娃娃菜种子的萌发和幼苗生长有显著的影响。

NO是在植物体内新发现的一种生物活性分子，研究表明，其作为信号分子广泛参与植物对各种逆境胁迫的应答过程[24-25]。本研究中，不同浓度的SNP能缓解Cr对娃娃菜种子萌发和幼苗生长的抑制作用，在施加SNP后，娃娃菜种子的发芽率、发芽势、发芽指数以及胚芽和胚根的长度、鲜重和干重均有提高，这一结果与前人的研究结果相似[26]。SNP能促进种子萌发，可能是由于NO能提高蛋白酶和淀粉酶的活性，从而加速了种子内大分子贮藏营养物质降解为可吸收的小分子[27]。结果显示，添加SNP能显著提高Cr胁迫下娃娃菜种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数，说明SNP可以在一定程度上缓解Cr胁迫对种子萌发的抑制作用。

叶绿素是光合作用的主要色素，其含量的高低在一定程度上反映了植物光合作用的强弱，直接标志着植物的生长能力。低浓度Cr胁迫促进叶绿素合成，而高浓度则抑制叶绿素的合成[28-29]。本研究中，施加不同浓度的SNP使娃娃菜幼苗叶片的Chl含量，其中SNP浓度为100～200 μmol·L-1时，增加的效果最佳。Cr胁迫导致Chl含量的降低，可能是Cr的胁迫使叶绿素降解酶活性提高，加速了叶绿素的降解，导致叶绿素含量降低[30]，此外，Cr会引起植物体内ROS积累[31]，过量的ROS会损伤细胞的膜系统，破坏叶绿体中类囊体结构，导致光合作用的场所受到严重损伤，从而阻碍了光合作用进而影响植物的生长发育[32]。SNP对Cr胁迫的缓解作用可能是由于NO清除了部分ROS，缓解了Cr对叶绿体的膜结构的毒害作用，提高了幼苗的光系统(Ⅱ)光化学转换效率，提高了植物的潜在光合活性[31]，以及活化了叶绿素合成的相关酶类，提高了叶绿素的合成[33]，从而增加了有机物质的积累，促进幼苗的生长。

本实验发现SNP能有效缓解Cr对植物的损伤，但是这种缓解作用与NO的浓度相关，适中浓度(100～200 μmol·L-1)的SNP处理能够显著地增加Chl的含量，降低MDA含量和REC，以及提高SOD、CAT活性和增加Pro的积累。但随着SNP浓度的进一步增大，对Chl、MDA、REC、SOD、CAT和Pro的影响并不显著。这表明，SNP缓解Cr对娃娃菜胁迫的能力并不随其浓度的增加而增加，且高浓度的NO对植物具有损伤性，这与陈银萍等[31]和杨志娟等[39]的研究结果一致。有研究表明，低浓度的NO可以作为ROS清除剂缓解Cr对植物的胁迫作用，而高浓度的NO则可与ROS产生毒性更加剧烈的氧化物，如过氧亚硝酸(HOONO)，对细胞膜的损伤更严重。此外，本实验发现适中浓度(100～200 μmol·L-1)的SNP能够有效的提高娃娃菜种子的萌发率、促进胚芽和胚根的生长，而当SNP浓度继续升高时，种子的萌发率和胚芽、胚根的生物量开始呈现降低趋势，这同样证实了高浓度NO对植物具有胁迫作用。因此，只有最适的NO浓度才能在植物体内起到最佳的生物学效应，浓度过高或过低的NO都无法起到缓解氧化胁迫的作用。

4 结 论

Cr对娃娃菜种子的萌发、胚芽和胚根的生长均具有抑制作用，通过添加外源NO可以提高娃娃菜种子的萌发率、增加胚芽和胚根生物量、增加幼苗叶片中Chl含量、降低MDA含量和REC、提高抗氧化酶活性和增加Pro的积累量，清除幼苗中的ROS，缓解膜脂过氧化损伤，维持细胞膜的稳定性，从而降低Cr对娃娃菜种子萌发和幼苗生长的抑制作用。此外，SNP的缓解作用又与其浓度有关，浓度为200 μmol·L-1的SNP缓解Cr对娃娃菜胁迫的能力最佳，过高或过低浓度的SNP缓解Cr胁迫的效果均不理想。