西藏3种冷水鱼皮肤病灶中潜在病原微生物分析

陈美群，潘瑛子，牟振波，刘海平，周建设，王万良，曾本和，扎西拉姆

(西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，西藏 拉萨 850032)

【研究意义】黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻是西藏地区重要的冷水性经济鱼类，主要分布于雅鲁藏布江中、上游的干支流及附属水域，多在水质清澈、砾石底质的河道营底栖生活[1]。由于西藏冷水鱼生长缓慢、性成熟较晚、繁殖力较低、种群数量较少、外来鱼种入侵等因素导致其资源量逐年枯竭[2-3]，特别是黑斑原鮡等多种冷水鱼的资源现状已经非常严峻，已成为极度濒危鱼类，积极开展西藏冷水鱼资源的研究与保护迫在眉睫。【前人研究进展】目前，黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻的研究主要集中在分类学[4]、食性组成[5]、胚胎发育特征[6-7]、生长繁殖特性[8]等方面，但有关冷水鱼病原微生物的研究却鲜有涉及，仅本课题组利用Illumina-Miseq高通量测序技术对黑斑原鮡和尖裸鲤开展了健康个体与病变死亡个体的表皮皮肤粘液及肠道内容物的微生物多样性探讨，研究表明细菌和真菌的群落结构变化是黑斑原鮡和尖裸鲤病变死亡的主要原因之一[9-10]。【本研究切入点】本文通过平板法对黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻等3种冷水鱼皮肤病灶部位中多种可培养微生物进行了分离鉴定。【拟解决的关键问题】以期明确引起上述冷水鱼皮肤病变死亡的主要病原微生物种类，为雅鲁藏布江流域冷水鱼微生物传染病的防控与治疗提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验样品采集及患病鱼的临床症状 黑斑原鮡[体重：(153±0.4)g，体长：(24.6±0.2)cm，样品编号1]、异齿裂腹鱼[体重：(1232.4±0.3)g，体长：(53.7±0.5)cm，样品编号2]和拉萨裸裂尻[体重：(272.7±0.5)g，体长：(36.3±0.4)cm，样品编号3]均为西藏自治区农牧科学院水产科学研究所于2017年在西藏拉萨国家农业科技园区养殖基地人工养殖过程中的患病鱼，在采集样品前对患病鱼的临床症状进行了观察和记录，黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻皮肤病灶部位病变主要表现为皮肤充血溃烂、有白灰色斑块、附着有白色绒毛状霉菌(图1)。待上述驯养冷水鱼死亡后2 h之内用无菌方式采集每种5尾死亡鱼类皮肤病灶部位样品，于实验室6 h之内处理完毕。

图1 冷水鱼皮肤病灶部位

1.1.2 培养基 NA培养基：蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，琼脂 18.0 g，pH 7.0±0.1，蒸馏水定容至 1000 mL；TSA培养基：胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨 5 g，氯化钠 5g，琼脂 15 g，pH 7.3±0.2，蒸馏水定容至 1000 mL；LB固体培养基：酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，氯化钠 10 g，pH值7.0±0.2，蒸馏水定容至 1000 mL；PDA培养基：马铃薯 300 g，葡萄糖 20g，琼脂 15 g，氯霉素 0.1 g，pH值自然，蒸馏水定容至 1000 mL；孟加拉红培养基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁 0.5 g，琼脂 15 g，孟加拉红 0.03 g，氯霉素 0.1 g，pH 7.2±0.2，蒸馏水定容至 1000 mL。

1.2 病灶部位细菌和真菌的分离纯化[11]

将患病鱼体放于灭菌不锈钢方盘中，用75 %灭菌酒精冲洗病灶部位15 s、重复3次，然后再用灭菌水冲洗病灶部位15 s、重复3次，最后用灭菌手术刀刮取病灶部位皮肤样品，取5 g病灶部位样品剪碎加入25 mL无菌水150 r/min震荡30 min，取100 μl上清液均匀涂布于细菌分离培养基(NA、TSA)上、每种培养基设3个重复，细菌于15 ℃培养24 h后挑取形态不同的菌落反复划线于LB固体培养基上直至获得纯培养物，细菌纯培养物于LB斜面培养基上4 ℃保藏备用；取100 μl上清液均匀于真菌分离培养基(PDA、孟加拉红培养基)上、每种培养基设3个重复，真菌于15 ℃培养7 d后挑取形态不同的菌落边缘反复点接于PDA培养基上直至获得纯培养物，真菌纯培养物于PDA斜面培养基上4 ℃保藏备用。

1.3 细菌和真菌的鉴定

形态学鉴定：细菌形态学鉴定参考《Taxonomic outline of the prokaryotes bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edition》[12]、真菌形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》[13]；分子生物学鉴定：纯培养物使用TIANGEN公司基因组抽提试剂盒提取总 DNA，然后用于目的基因的扩增。细菌16S rDNA目的基因PCR扩增采用通用引物27F/1492R[14]，真菌ITS区目的基因PCR扩增采用通用引物 ITS1/ITS4[15]。扩增程序如下：94 ℃ 5 min；94℃ 30s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30 个循环；72 ℃ 10 min。取 2 μl PCR 产物，1 % 琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物送交北京亿明复兴生物科技有限公司测序，利用 BLAST 软件将测定得到的基因序列与NCBI 数据库进行序列比对分析，获取NCBI 数据库中相近菌株的基因序列，然后用 CLUSTAL X 软件进行全序列比对，利用 MEGA 7.0中的邻接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系统发育树[16]。

表1 冷水鱼病灶部位微生物平板分离

2 结果与分析

2.1 患病鱼病灶部位微生物的分离

由表1可知，从3种冷水鱼病灶部位共计分离得到151株细菌和72株真菌，其中黑斑原鮡病灶部位分离得到39株细菌和9株真菌、异齿裂腹鱼病灶部位分离得到71株细菌和45株真菌、拉萨裸裂尻病灶部位分离得到41株细菌和18株真菌。所有分离得到的微生物经过形态学初步鉴定，筛重后选取33株细菌和54株真菌进行分子生物学鉴定。

2.2 冷水鱼细菌16s rDNA序列的鉴定

由表2可知，对共计33株细菌进行了分子生物学鉴定，结果发现：分离自西藏3种冷水鱼病灶部位的细菌主要分布在α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、异常球菌纲(Deinococci)、芽孢杆菌纲(Bacilli)及厚壁菌门(Firmicutes)。西藏3种冷水鱼病灶部位细菌主要有气单胞菌属(Aeromonas)、不动细菌属(Acinetobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、异常球菌属(Deinococcus)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、节细菌属(Arthrobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、考克氏菌属(Kocuria)、马赛菌属(Massilia)、乳球菌属(Lactococcus)、Deefgea和Paenisporosarcina等21属。序列BLAST比对及系统进化分析结果表明(图2)： 1-X-1、3-X-11、3-X-15、3-X-19等菌株与AeromonashydrophilaSAS13(MF612172.1 )具有99 %的同源性，Aeromonashydrophila是鱼类常见的条件致病菌，典型的人-兽-鱼共患病病原菌，可引起鱼类烂腮病、赤皮病、出血病及红鳍病等多种疾病[17]。1-X-21与Paenisporosarcinasp. ARK-14-voll(HF912842.1)具有100 %的同源性，Paenisporosarcina属细菌是Krishnamurthi S等[18]2009年对Sporosarcina属细菌重新分类而鉴别的一个细菌新属。1-X-22、1-X-32与Chryseobacterium属细菌具有较高的同源性，Chryseobacterium是一个新近命名的菌属，由原先属于黄杆菌属的6个种和3个新种构成，Chryseobacteriumpiscicola由Ilardi P等[19]从芬兰养殖场生病的大西洋鲑皮肤病灶中分离得到，是大西洋鲑的主要致病微生物。2-X-8、3-X-9与Pseudomonas属具有100 %的同源性，Pseudomonas属微生物是鱼类重要的腐败菌之一，能够加速鱼体病变部位的腐烂变质[20]。2-X-26与PlesiomonasshigelloidesAW28(GU324301.1)具有99 %的同源性，Plesiomonasshigelloides可引起鱼类体色发黑、体表出血、鳞片脱落、鳍条溃烂等症状，是多种鱼类重要的病原菌[21-22]。3-X-8与Flavobacteriumsp. T56L(JX287816.1)具有99 %的同源性，Flavobacterium属细菌广泛存在于水体、土壤和动植物等环境中，Leydis Z等[23]从患病的虹鳟鱼中分离得到Flavobacteriumplurextorumsp. nov.新种，是潜在的鱼类病原菌。

表2 冷水鱼可培养细菌鉴定

续表2 Continued table 2

菌株编号Sample name近源序列Similarity sequence相似度(%)Similarity分类地位(属)Genus登陆号Landing number1-X-24Micrococcus sp. AX5(KP126827.1 )100MicrococcusMH3079811-X-32Chryseobacterium sp. ARS145-11(JX827616.1 )99ChryseobacteriumMH3079821-X-33Janthinobacterium sp.M1-12(MG757982.1)99JanthinobacteriumMH3079831-X-35、2-X-37Microbacterium sp.KBL11(MG576164.1 )100MicrobacteriumMH3079842-X-8、3-X-9Pseudomonas sp. DNE-S2(MF803833.1 )100PseudomonasMH3079852-X-26Plesiomonas shigelloides AW28(GU324301.1)99PlesiomonasMH3079862-X-56Macrococcus caseolyticus GCFS2(MG722794.1 )99MicrococcusMH3079873-X-2Deinococcus sp. MZDSW(KY435503.1 )100DeinococcusMH3079883-X-7Moraxella sp.GM2(JF837191.1)99MoraxellaMH3080013-X-8Flavobacterium sp. T56L(JX287816.1)99FlavobacteriumMH3079893-X-14Exiguobacterium aurantiacum TAGEM15-70-B31(MG685824.1 )99ExiguobacteriumMH3079903-X-17Serratia liquefaciens Mt16(MF624481.1 )99SerratiaMH3079913-X-22Brevundimonas intermedia NW33(JF915341.1 )99BrevundimonasMH3079923-X-23Arthrobacter sp. MDT2-15(JX949674.1 )99ArthrobacterMH3079933-X-24Sphingomonas sp. NA53(LN832013.1 )100SphingomonasMH3079993-X-25Sphingomonas sp. CCGE4035(GU980224.1 )99SphingomonasMH3079943-X-28Kocuria polaris PGd6(MG029449.1)100KocuriaMH3080003-X-32、3-X-27Arthrobacter sp.FRA03P48(MG860335.1 )99ArthrobacterMH3079953-X-34Massilia aurea HME9229(KF911334.1 )99MassiliaMH3079963-X-36Deefgea rivul S-T-TSA-63(JX860598.1)100DeefgeaMH3079973-X-42、3-X-13Lactococcus piscium TJ-1-25(MF157588.1 )100LactococcusMH307998

图2 冷水鱼皮肤病灶中可培养细菌系统进化树

表3 冷水鱼可培养真菌鉴定

2.3 冷水鱼真菌ITS序列的鉴定

由表3可知，对共计54株真菌进行了分子生物学鉴定，结果发现：分离自西藏3种冷水鱼病灶部位的真菌主要分布在接合菌纲(Zygomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、卵菌纲(Oomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)、酵母纲(Saccharomycetes)和丝孢纲(Hyphomycetes)。3种冷水鱼病灶部位真菌主要有毛霉属(Mucor)、枝孢菌属(Cladosporium)、根霉属(Rhizopus)、茎点霉属(Phoma)、派伦霉属(Peyronellaea)、青霉属(Penicillium)、水霉属(Saprolegnia)、链格孢属(Alternaria)、小球壳孢属(Microsphaeropsis)、镰刀菌属(Fusarium)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、网孢菌属(Filobasidium)、假丝酵母属(Candida)、支顶孢属(Acremonium)和隐球菌属(Cryptococcus)等15属。序列BLAST比对及系统进化分析结果表明(图3)： 1-Z-1、2-Z-39与MucorracemosuslhWWF65具有100 %的同源性，毛霉属(Mucor)真菌通常在机体营养不良、抵抗力低下和体表损伤时侵入机体组织，是一类致命的条件致病菌，杨鸢劼等[24]对暗纹东方鲀病理组织切片观察发现毛霉属真菌可在鱼体形成环状苍白圈，体表病灶中心常出现糜烂溃疡，最后延伸至肌肉导致鱼体死亡。2-Z-4与SaprolegniaparasiticaCNUaq1具有99 %的同源性，水霉属(Saprolegnia)真菌可引起水生动物感染水霉病，水霉病是现代水产养殖业的重要危害病原菌之一，水霉感染后会造成鱼体死亡、鱼卵孵化率降低等危害，我国致病性水霉菌主要为寄生水霉(Saprolegniaparasitica)和多子水霉(Saprolegniaferax)，其中寄生水霉孢子萌发快，侵袭能力强，对我国淡水鱼类危害尤其严重，每年对淡水水产养殖业造成巨大经济损失[25-26]。

图3 冷水鱼皮肤病灶中可培养真菌系统进化树

3 讨论与结论

目前，有关雅鲁藏布江流域冷水鱼微生物的研究鲜有报道，本文首次对雅鲁藏布江流域黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻等3种冷水鱼皮肤病灶中可培养微生物进行了分析，研究结果表明：西藏3种冷水鱼皮肤病灶部位可培养细菌主要分布在α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、异常球菌纲(Deinococci)、芽孢杆菌纲(Bacilli)及厚壁菌门(Firmicutes)等1门、7纲21属25种，可培养真菌主要分布在接合菌纲(Zygomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、卵菌纲(Oomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)、酵母纲(Saccharomycetes)和丝孢纲(Hyphomycetes)等7纲15属24种，从3种冷水鱼皮肤病灶部位共计分离得到36属49种微生物，黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻等3种冷水鱼皮肤病灶部位中可培养微生物种类较多。

微生物性病原菌引起的鱼类疾病具有发病急、传播快、发病率高和死亡率高等特点，是危害较大的鱼类常见疾病，近年来备受国内外鱼病研究工作者的关注[27-28]。本文从西藏冷水鱼皮肤病灶部位分离的Aeromonashydrophila、Paenisporosarcinasp.、Chryseobacteriumsp.、Pseudomonassp.、Plesiomonasshigelloides、Flavobacteriumsp.、Mucorsp.和Saprolegniaparasitica等已被报道是多种鱼类的病原菌，因此，笔者认为能够对西藏冷水鱼的健康养殖形成威胁的这8种病原微生物值得重点关注。另外，沙雷氏菌属(Serratia)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)等菌株能够产生蛋白酶、脂肪酶等活性物质，它们是加速肉类食品腐败变质的重要微生物，在鱼体表出现斑状病变后能够迅速感染鱼肌肉组织，导致鱼类体表常出现大面积糜烂溃疡，加速鱼类病理死亡[29-30]。同时，本文从冷水鱼病灶部位还分离得到微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、节细菌属(Arthrobacter)等放线菌和根霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、小球壳孢属(Microsphaeropsis)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、支顶孢属(Acremonium)等真菌，它们能够产生大量的化学结构新颖、抑菌效果较好或有特殊作用的生物活性物质，可能对上述病原微生物的防治具有贡献[31-33]。

本文对西藏3种冷水鱼皮肤病灶中可培养微生物及其病原微生物进行了探讨分析，初步明确了黑斑原鮡、异齿裂腹鱼和拉萨裸裂尻等3种冷水鱼皮肤病灶中可培养微生物种类及其潜在病原微生物种属，下一步将继续开展以下几方面的研究工作：①开展8种冷水鱼疑似病原微生物的人工感染及其药物敏感试验，明确疑似病原微生物的致病特性及其防治措施；②研究Micrococcussp.、Microbacteriumsp.、Exiguobacteriumsp.、Arthrobactersp.、Rhizopussp.、Penicilliumsp.、Microsphaeropsissp.、Leptosphaeriasp.、Acremoniumsp.等病灶分离菌株对8种疑似病原微生物的拮抗作用，提取上述分离微生物的次级代谢化合物并开展其抑菌活性分析；③探讨沙雷氏菌属(Serratia)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)等分离菌株的蛋白酶、脂肪酶活性，明确其在冷水鱼病变死亡后期的促进鱼肉腐败、变质及溃烂等协同效果。