UPLC-MS/MS同时测定人血浆中替米沙坦与氨氯地平浓度

李艳玲 王曼 王振磊 王鸿芡 夏伯姗 岳娇梁秀芳 南峰 向瑾 王永生 秦永平 张梅

摘要：建立UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中替米沙坦與氨氯地平的浓度，用于研究替米沙坦/氨氯地平片的药代动力学。采用Waters BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱，流动相A：甲酸：氨水：水（1：0.2：1000，v/v/v），流动相B：甲酸：氨水：乙腈：水（1：0.2：950：50，v/v/v/v），进行梯度洗脱，流量0.3mL/min，以d3-替米沙坦、d4-氨氯地平作内标。血浆样本液液萃取后，采用SHIMADZU SIL-30 AD型UPLC进样分离，美国AB Sciex QTRAP 5500质谱仪在MRM模式下检测。结果表明：替米沙坦在0.50～500ng/mL范围内，氨氯地平在0.05～8.00ng/mL范围内线性良好;替米沙坦及内标的保留时间均为1.43～，氨氯地平及内标的保留时间均为1.31min;替米沙坦萃取回收率103.0%～104.2%、氨氯地平萃取回收率54.6%～66.5%;方法的特异性、灵敏性、线性、精密度、准确度、基质效应以及稳定性验证数据均符合相关要求。该法快速、灵敏、专属性强、重现性好，适用于替米沙坦/氨氯地平的血药浓度测定。

关键词：UPLC-MS/MS;替米沙坦;氨氯地平;血药浓度

中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）07-0066-08

收稿日期：2019-01-21;收到修改稿日期：2019-03-06

作者简介：李艳玲（1994-），女，山西运城市人，硕士研究生，专业方向为药物分析。

通信作者：张梅（1963-），女，四川成都市人，教授，主要从事中药及复方物质基础与质量标准化研究。

0 引言

高血压与心脑血管疾病密切相关，其高发病率和高致死率极大地影响公众健康[1-3]。替米沙坦（telmlsartan）是一种广泛用于治疗高血压和心力衰竭的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensin 11 receptorblockers，ARBs）[4-6]，氨氯地平（amlodipine）是一种长效、可有效控制血压的二氢吡啶类钙通道拮抗剂[7]。研究表明，替米沙坦和氨氯地平在单药治疗高血压方面已显示出良好的疗效[8]，而替米沙坦/氨氯地平片（40/5mg）是替米沙坦和氨氯地平的复方制剂，其在降低血压方面被认为比单药治疗更有效、更耐受，且优于其他传统联合用药方案[9-10]。在研究替米沙坦/氨氯地平片的药代动力学及生物利用度时，需要测定两种药物的血药浓度。目前，国内外文献报道的LC-MS/MS分析方法多集中于单独测定生物样本中替米沙坦[11-13]或氨氯地平[14-16]的含量，同时测定人血浆中替米沙坦和氨氯地平的方法国内外较少报道。张鹤等[17]在测定Beagle犬血浆中替米沙坦和氨氯地平的浓度时分别采用乙腈沉淀蛋白测定替米沙坦和液液萃取测定氨氯地平两个方法，需要处理两份样本、进样两次，工作量大、耗时长，灵敏度低，且采用非同位素内标奈普生和盐酸克伦特罗;Ravi VB等[18]采用固相萃取（SPE）同时测定人血浆中替米沙坦和氨氯地平的浓度，以非同位素标记药物卡马西平作内标，存在血浆用量大（250μL）、成本高、耗时长，精密度较差等问题。本研究使用同位素标记药物作内标，用100μL血浆，在碱性条件下通过液液萃取，一次进样可同时测定血浆中高响应、高浓度的替米沙坦和低浓度的氨氯地平浓度，具有线性范围广、灵敏度高、血浆用量少、准确度和精密度好、操作简便，耗时短、成本低等特点，适用于高通量的分析检测工作，已成功应用于健康志愿者口服替米沙坦/氨氯地平片（40/5mg）后的临床药代动力学及生物利用度研究的大量样本（5400余个）检测，结果良好。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本SHIMADZU SIL-30 AD型高效液相色谱仪;美国AB Sciex QTRAP 5500三重四级杆串联质谱仪;数据采集用Analyst工作软件（Version 1.6.3）;5810R低温离心机（德国Eppendorf公司）;XP205DR十万分之一电子分析天平（法国Mettler Toledo公司）;Targin BT-Ⅲ水浴式氮吹仪（北京踏锦科技有限公司）。

1.2 试药

苯磺酸氨氯地平对照品，中国食品药品检定研究院，批号100374-201204，纯度99.9%：替米沙坦对照品，中国食品药品检定研究院，批号100629-201202，纯度99.6%;同位素标记的替米沙坦（d3-替米沙坦）对照品，加拿大TRC公司，批号1-TEK-100-2，化学纯度97.0%，同位素纯度99.1;同位素标记的氨氯地平（d4-氨氯地平）对照品，加拿大TRC公司，批号11-PSB41-1，化学纯度98.0%，同位素纯度99.7%。试验制剂（替米沙坦氨氯地平片，四川自豪时代药业有限公司，批号：160405，规格：40/5mg/片）;参比制剂（替米沙坦氨氯地平片，勃林格殷格翰国际药业有限公司，批号：505254，规格：40/5mg/片）。乙腈、甲酸，美国Thermo Fisher公司，色谱纯;氨水，二氯甲烷、异丙醇，成都科隆公司，分析纯;超纯水，美国Millipore公司Millipore型超纯水器自制。

2 方法

2.1 色谱条件

色榭主：Waters BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱，美国Waters公司;柱温：40℃;流动相A：甲酸：氨水：水（1：0.2：1000，v/v/v），流动相B：甲酸：氨水：酬青：水（1：0.2：950：50，v/v/v/v），流量0.3mL/min。梯度洗脱：0.01～1.10min，B相38%～100%;1.10～1.80min，B相维持100%;1.80～1.81min，B相100%～38%：1.81～2.50min，B才匪时寺38%。流量：0.3mL/min，进样量：5μL，进样时长：2.50min。

2.2 质谱条件

采用多反应离子监测（MRM，multiple reactionmonitoring），ESI（电喷雾离子源，electron sprayionization）正离子化方式检测，气帘气35 psi（1psi=6894.757Pa），雾化气60psi，加热辅助气60psi，喷雾电压5500V，离子源温度500℃，去簇电压70V，射人电压10V，射出电压13V。替米沙坦、d3-替米沙坦的检测离子对分别为（m/z）515.2→276.2、518.2→279.2，碰撞能量38V;氨氯地平、d4-氨氯地平的检测离子对分别为（m/z）409.2→238.2、413.2→238.2，碰撞能量15V。

2.3 溶液的配制

2.3.1 替米沙坦/氨氯地平标准曲线储备液及工作液配制

用十万分之一天平分别精密称取替米沙坦对照品10mg（相当于替米沙坦9.96mg），苯磺酸氨氯地平对照品10mg（相当于氨氯地平7.20mg），用甲醇分别定容于50mL容量瓶，混匀即得质量浓度为200μg/mL的替米沙坦储备液和150μg/mL的氨氯地平储备液。替米沙坦/氨氯地平储备液用35%乙腈水溶液进一步稀释成相应的标准曲线工作液，替米沙坦浓度为10000，9000，5000，1600，400，100，20，10ng/mL，氨氯地平浓度为160，144，80，40，16，4，2，1ng/mL，置-35℃冰箱保存备用。

2.3.2 替米沙坦/氨氯地平质控储备液及工作液配制

采用2.3_1方法分别制得质量浓度为200μg/mL的替米沙坦储备液和150μg/mL的氨氯地平储备液。替米沙坦/氨氯地平储备液用35%乙腈水溶液进一步稀释成相应的质控工作液，替米沙坦浓度为8000，800，30，10ng/mL，氨氯地平浓度为128，20，3，1ng/mL，置-35℃冰箱保存备用。

2.3.3 内标储备液及工作液配制

用10mL甲醇溶解d3-替米沙坦对照品1mg（规格：1.0mg/#k）于10mL容量瓶中，即得浓度为100μg/mL的d3替米沙坦储备液;用十万分之一天平精密称取d4-氨氯地平对照品1mg（规格：5.0mg/瓶），置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定至刻度，即得浓度为100μg/mL的d4-氨氯地平储备液。d3-替米沙坦/d4-氨氯地平储备液用35%乙腈水溶液进一步稀释成内标工作液，制得浓度为20ng/mL的d3-替米沙坦和0.5ng/mL d4-氨氯地平（d3-TM-20ng/mL+d4-AL-0.5ng/mL），置-35℃冰箱保存备用。

2.4 样品预处理与测定方法

取血浆样本100μL，加入50μL内标工作液，加入50μL0.5%氨水，混匀后加入2.0mL，萃取剂（二氯甲烷：异丙醇=97：3），涡旋混合5min，低温离心5min（3000r/min，8℃），射水真空泵负压抽弃水层，转移下层有机层至尖底试管中，于40℃水浴中通空气流挥干。残渣用50μL35%乙腈（含0.2%甲酸）复溶，取上清液进样5μL。

2.5 方法学相关考察

2.5.1 专属性

在本实验条件下，使用6个不同来源的空白基质，按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作，分析评价药物及内标出峰处是否产生干扰，考察替米沙坦和氨氯地平的专属性。

2.5.2 标准曲线

将替米沙坦/氨氯地平标准曲线系列工作液按照1：19（v/v）的比例平行加入到空白血浆中，得替米沙坦质量浓度为500，450，250，80，20，5，1，0.5ng/mL和氨氯地平质量浓度为8，7.2，4，2，0.8，0.2，0.1，0.05ng/mL的替米沙坦/氨氯地平混合标准曲线血浆样品。按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作，以样品和内标的峰面積比（area ratio）为纵坐标，样品浓度（ng/mL）为横坐标，以1/c²为权重系数进行回归，得血浆中替米沙坦和氨氯地平的标准曲线。

2.5.3 准确度与精密度

将替米沙坦/氨氯地平质控系列工作液按照1：19（v/v）的比例平行加入到空白血浆中，得替米沙坦质量浓度为400，40，1.5，0.5ng/mL（定量下限）和氨氯地平质量浓度为6.4，1，0.15，0.05ng/mL（定量下限）的替米沙坦/氨氯地平混合质控血浆样本，每个浓度平行6份，按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作检测3批，分析计算批内、批间精密度和准确度。定量下限是标准曲线上的最低浓度点。分析方法的准确度表示为标示浓度的回收率（RE%）。精密度表示为测量值的相对标准偏差（RSD）。

2.5.4 稀释系数考察

制备高浓度血浆样本，理论浓度分别为替米沙坦800ng/mL，氨氯断平12.8ng/mL，将空白血浆与检测血浆按照=1：1（v/v）稀释6份，按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作后进样。计算其精密度和准确度。

2.5.5 萃取回收率

制备高、中、低3个浓度质控血浆样本，每个浓度3份，按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作，以提取后的高、中、低3个浓度质控血浆样本进样得到的峰面积与空白血浆直接加入相应基质效应工作液后进样得到的未提取峰面积的比值，计算血浆中替米沙坦、氨氯地平与内标d3-替米沙坦、d4-氨氯地平的萃取回收率。

2.5.6 基质效应

取6个不同来源的空白血浆，每一空白血浆6份，共计36份，按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作，向挥干后的空白血浆样本中加入底、高浓度相应进样浓度工作液含内标工作液，分别得到基质样品中替米沙坦、氨氯地平与内标d3-替米沙坦、d4-氨氯地平的峰面积，同时以相应进样浓度工作液直接进样得到对照样品中药物及内标的峰面积。基质效应为基质样品的平均峰面积与对照样品的平均峰面积的比值。

2.5.7 稳定性

以35%乙腈（含0.5%甲酸）为溶剂，将相应储备液配制成与标准曲线最高管进样浓度一致的稳定性考察工作液，每个分别制备6份，以峰面积比值计算平均稳定性偏差考察储备液短期保存稳定性和长期保存稳定性，工作液短期保存稳定性和长期保存稳定性。

按照实际测定过程可能影响药物稳定性的因素，以涵盖血浆样品的预期保存条件，分别制备高、低2个浓度质控血浆样本，按照“2.4样品预处理与测定方法”下操作，记录色谱峰面积，由当日标准曲线计算其浓度，与配制浓度比较考察各因素的稳定性。

3 结果

3.1 专属性

空白血浆色谱图见图1（a）和图1（b），替米沙坦（TM）、氨氯地平（AL）及其内标（d3-TM、d4-AL）出峰处均无响应。最低定量限浓度血浆样本进样后，替米沙坦与内标d3-替米沙坦的保留时间为1.43min、氨氯地平与d4-氨氯地平的保留时间为1.31min。其色谱图见图Z（o）和图1（d），由图可知血浆内源性杂质均不干扰替米沙坦、内标d3-替米沙坦及氨氯地平、d4-氨氯地平的测定。

3.2 标准曲线

以待测物浓度x为横坐标，待测物与内标的峰面积比值y为纵坐标，进行线性回归得替米沙坦、氨氯地平的标准曲线。替米沙坦：y=0.0716x+0.0103（r²=0.9988）;氨氯地平：y-0.916x-0.001 94（r²=0.9990），权重系数为1/c²。结果表明，替米沙坦在0.5～500ng/mL、氨氯地平在0.05～8ng/mL范围线性良好。定量下限是指标准曲线上的最低浓度点，替米沙坦信噪比（S/N）为33，氨氯地平信噪比（S/N）为19.8，

3.3 准确度与精密度

如表1所示，替米沙坦每一浓度水平样品的批内精密度（RSD%）在0.8%～5.2%之间，批间精密度在3.1%～7.3%之间;批内准确度（RE%）在89.4%～109.2%，批间准确度在96.1%～105.1%。氨氯地平每一浓度水平样品的批内精密度在 0.9%～6.7%之间，批间精密度在3.5%～5.9%之间;批内准确度在94.0%～109.4%，批间准确度在98.3%～105.4%。其中最低管浓度（定量下限）替米沙坦准确度范围为89.4%～99.8%，精密度小于6.2%，氨氯地平准确度范围为94.0%～101.7%，精密度小于6.7%。

3.4 稀释系数考察

分别考察了2倍的稀释验证，结果可知，替米沙坦精密度为2.8%，氨氯地平精密度为1.1%，替米沙坦准确度偏差为-1.9%，氨氯地平准确度偏差为6.1%。

3.5 基质效应

以内标校准后测定6次的平均基质效应低、高浓度血浆样本中替米沙坦分别为100.4%，100.8%，氨氯地平分别为107.0%，106.5%;替米沙坦RSD分别为3.6%和3.4%，氨氯地平分别为1.2%和1.2%，结果见表2。

3.6 萃取回收率

替米沙坦、氨氯地平在低、中、高3个质控水平的回收率分别为103.0%～104.2%和54.6%～66.5%，表明萃取效率令人满意，且无浓度依赖性。结果见表2。

3.7 稳定性

储备液稳定性数据及血浆样本各项相关稳定性数据如表3、表4所示，平均稳定性偏差均小于10%，符合稳定性相关要求。

4 应用

本法已用于中国健康受试者，在3个周期内分别单次口服给予替米沙坦/氨氯地平片的血药浓度测定，其单次给药的平均血药浓度一时间曲线如图2所示。由图可知，试验制剂与参比制剂单次给药替米沙坦、氨氯地平的药时曲线变化趋势一致。

5 讨论

5.1 样本预处理

本研究中替米沙坦、氨氯地平及其内标为中等极性化合物，由于沉淀蛋白法不能浓集样本，氨氯地平浓度低，检测灵敏度无法满足定量要求，因此只能考虑具有浓集功能的固相萃取或液液萃取法，固相萃取成本高，条件优化较为复杂，操作費时，故确定采用液液萃取。在进行萃取剂的选择时，分别考察了甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯。甲基叔丁基醚萃取回收率过低;乙酸乙酯萃取回收率与基质效应虽合格，但易造成色谱柱堵塞;二氯甲烷-异丙醇（97：3，v/v）作萃取剂时，氨氯地平萃取回收率仍达不到要求，为了提高氨氯地平的萃取回收率，考虑其结构中的含氮杂环，发现萃取时加入0.5%氨水的碱性环境，药物及内标的萃取回收率和基质效应均合格（萃取回收率大于50%，基质效应小于15%），方法学评价结果证明了这一点。

5.2 内标选择

本研究选用的是同位素内标，其药物与内标的色谱行为相似、萃取回收率平行、离子化效应相近，测定结果更准确，较文献使用的内标：盐酸克伦特罗、奈普生[17]、卡马西平[18]等更为理想。d3-替米沙坦做内标由于有同位素影响，在药物检测离子对处有峰，为了使内标在药物出峰处的响应值低于最低检测限的20%，我们降低了内标的使用量。

5.3 色谱质谱条件

替米沙坦为高浓度，高响应，氨氯地平为低浓度，低响应，高浓度替米沙坦由于响应太高而超出质谱响应线性范围，不能准确定量，我们通过调整质谱参数，使替米沙坦CE由42V降低到38V，响应调整至合理水平，实现一针进样可同时分析两个浓度差别大的样本;试验采用梯度洗脱将两个药物成分保留时间调整到比较合适，替米沙坦保留时间为1.43min，氨氯地平为1.31min，保证两个成分既能同时定量又互不干扰;且待每个样本出峰后用95%乙腈冲洗色谱柱平衡后再进样，降低了基质效应，使样本响应度始终保持一致。

6 结束语

本研究为同时定量测定健康受试者血浆中替米沙坦/氨氯地平的血药浓度，其中替米沙坦最低定量下限为0.50ng/mL，氨氯地平为0.05ng/mL，相较于单独或分开测定血浆中替米沙坦、氨氯地平的浓度（氨氯地平定量下限仅0.1ng/mL），我们实验建立了一种快速、灵敏的UPLC-MS/MS联用技术，方法简便，灵敏度高，精密度好，耗时短，成本低、血浆用量少（仅100μL），重现性好，适合高通量分析，已经成功应用于替米沙坦/氨氯地平片在中国健康受试者的药代动力学研究。

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（编辑：徐柳）