采用荧光光谱法研究DDAF与BSA的相互作用

王秀文 王颖莉 于茜 裴晓丽

摘要：研究新型反离子季铵盐DDAI与BSA的相互作用。通过单因素法，选出适宜的作用时间、Na浓度和pH值;并采用荧光光谱法和三维荧光光谱法研究DDAF与BSA的相互作用机制。作用时间15min，钠离子浓度为0.04mol/L、pH值为待测液的初始pH值为适宜的实验条件;不同温度（290.15，296.15，303.15，310.15K）下二者的双分子猝灭常数（K_q）分别为7.03×10¹⁰，8.53×10¹⁰，1.09×10¹¹，1.12×10¹¹L/（mol-s）;結合位点数（n）分别为1.17、0.84、0.97和1.02; AH和AS均大于0;三维荧光光谱显示，加入DDAF后，BSA的荧光峰发生蓝移，且荧光强度下降16.63%。DDAF和BSA为混合猝灭;二者以1：1结合;二者间的作用力是疏水作用力;DDAF使BSA氨基酸残基周围的疏水环境增强。

关键词：双癸基二甲基甲酸铰;牛血清白蛋白;荧光光谱法;三维荧光光谱法

中图分类号：TQ423：0657.3 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）07-0080-07

收稿日期：2018-11-23;收到修改稿日期：2019-01-15

基金项目：山西省留学回国人员科技活动择优资助项目（2017066）;太原科技大学博士启动基金（20162015）;山西省"1331工程”工程（技术）研究中心建设计划（晋教科[20]7]14号）

作者简介：王秀文（1981-），女，山西太谷县人，讲师，硕士，主要从事中药及其制剂的质量研究。

通信作者：王颖莉（1967-），女，山西太原市人，教授，博士，主要从事中药药效物质基础研究工作。

0 引言

双癸基二甲基甲酸铵（DDAF）是中国日用化学研究院有限公司合成的一种新型反离子季铵盐表面活性剂，属于阳离子表面活性剂。其阳离子部分为季铵盐，反离子为甲酸根（-HCOO-），化学结构如图1所示。DDAF在水溶液中电离而带正电荷，可以吸附在带负电的细菌细胞膜表面，影响细胞膜正常生理功能，具有良好的杀菌效果[1]。唐伟月等[2]研究表明，DDAF仅需10μg/mL，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率即可达到100%。该机构还研制了含DDAF的洗手液配方[1]，其抑菌性能达到GB 19877.1-、2005关于洗手液抑菌率不低于50%的要求。此外DDAF泡沫少、易降解，在抑菌清洗液方面有良好的开发前景[1]。

蛋白质是细胞的重要成分，是生命的基本物质，表面活性剂的杀、抑菌活性与蛋白质的相互作用是紧密相关的。研究表面活性剂与蛋白质的相互作用对深入了解表面活性剂的杀、抑菌作用机制、药代动力学以及毒理研究具有重要意义。其次，表面活性剂对皮肤的刺激作用，对头发、羊毛的柔顺作用等，都涉及到表面活性剂与蛋白质的相互作用，在工业、生物、制药和化妆品等领域中具有广泛意义[3-4]。

目前国内对于DDAF的研究不多[1-2，5-6]，也未曾发现有DDAF与BSA（牛血清白蛋白）相互作用的研究，因此本文采用荧光光谱法和三维荧光光谱法研究DDAF与BSA的相互作用，希望为扩大DDAF的应用范围提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 仪器与试剂

荧光分光光度计（F97 pro荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司）;智能酸度计（pHS-4C⁺，成都世纪方舟科技有限公司）;水浴锅（数显恒温水浴锅HH-2，金坛市杰瑞尔电器有限公司）;万分之一分析天平（JM-B-2003，余姚纪铭称重校验设备有限公司）。

牛血清白蛋白（生物技术级，96%，AladdinIndustrial Corporation）;DDAF（由中国日用化学研究院有限公司提供，质量分数84%）;高纯水（市售娃哈哈纯净水）;氯化钠（分析纯，北京康普汇科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

1.0×10^-4mol/L BSA溶液的配制：用万分之一分析天平准确称取约0.7g BSA样品，置于小烧杯内，用高纯水溶解，定量转移至100mL容量瓶，定容，摇匀。

2.06×10^-4mol/L DDAF溶液的配制：将DDAF样品摇匀（动作要轻、慢，防止气泡夹入），用1mL移液管准确移取0.1mL该样品，置于小烧杯中，用高纯水稀释，洗涤移液管内壁3次，定量转移至100mL容量瓶，定容，摇匀，制成2.06×10^-3mol/LDDAF的储备液。准确吸取10mL储备液至100mL容量瓶，用高纯水定容，摇匀，即得。

0.1mol/L NaCl溶液的配制：用万分之一分析天平准确称取约5.85g氯化钠，用高纯水溶解，定量转移至1000mL容量瓶，定容，摇匀。

上述溶液均放入4℃冰箱中保存，使用前取出，放至室温使用。

1.2.2 荧光光谱的测量条件

荧光发射光谱测量条件：激发波长283nm，扫描波长范围为290～450nm，扫描步长1nm，激发带宽10nm，发射带宽5nm，增益中（650V），扫描次数为3次。

三维荧光光谱测定条件：激发光波长范围为200～500nm;发射光波长范围为200～500nm：激发和发射狭缝宽度为5mm;激发光波长扫描间隔为5nm;扫描步长1nm。

每次测定前，均要用高纯水润洗石英比色皿3次，再用待测液润洗2～3次，每次测量均用同一比色皿。

2 结果与讨论

2.1 DDAF与BSA相互作用适宜条件的研究

2.1.1 不同浓度DDAF对BSA的荧光强度的影响

取编号为0～7号的10mL容量瓶，用1mL移液管分别准确移取1mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液，再用10mL移液管分别移入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0ml，2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，最后用高纯水定容，摇匀，静置15min，用荧光分光光度计，按照1.2.2项下荧光发射光谱测量条件，测量待测液中BSA的荧光强度，结果见表1和圖2。

从表1和图2可以看出，随着DDAF浓度的升高，BSA的荧光强度从503.6降至418.7，并且最大发射波长由342.3nm蓝移到333.3nm，说明DDAF对BSA有猝灭作用[7]。BSA分子的荧光发射光谱在270～350nm有吸收，这种吸收主要来自色氨酸（Ttp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）残基。Ttp、Tyr和Phe产生不同的荧光光谱，其荧光峰（λ_max）分别位于348nm、303nm和282nm，荧光强度比约为100：9：0.5，即Trp的荧光强度最大，因而可以认为342.3mm的荧光峰主要由Ttp所产生的[8]。荧光峰发生蓝移说明蛋白质转向了一个更加疏水的环境，说明DDAF结合在了BSA的Trp残基附近，导致7知残基周围环境的疏水性增强。

2.1.2 作用时间对BSA/DDAF相互作用的影响

取编号为0、1的100mL容量瓶，准确吸取10mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液于。号容量瓶，用高纯水定容至刻度;并准确吸取10mL 1.0×10^-4mol/LBSA溶液于1号容量瓶，再准确吸取10mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高纯水定容至刻度。全部待测液配完后开始计时，按照1.2.2项下荧光发射光谱测量条件，分别测量静置0，15，30，45，60，75，90，105，120min后待测液的荧光强度。测得的结果如图3所示。

由图可知，在0～120min内，随着时间的延长，未加入和加入DDAF的两组待测液中BSA的荧光强度分别基本维持在497、480左右，可能是二者相互作用的速度较快，且二者的复合物比较稳定。理论上说后续的实验可以在溶液配完之后立即检测，但考虑到后续研究作用机制的实验需要保温，为尽量避免无关因素的干扰，选择15min作为每项实验的适宜反应时间。

2.1.3 钠离子浓度对BSA/DDAF体系荧光强度的影响

离子强度对DDAF和BSA的相互作用具有一定影响，本文研究了NaCl浓度对DDAF和BSA的相互作用的影响。取A、B两组编号均为0-8的 10mL容量瓶，A组用1mL移液管准确移入1.0mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液，再分别准确移入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mL 0.1mol/L NaCl溶液，高纯水定容，摇匀。B组按上述操作加入1.0×10^-4mol/L BSA和0.1mol/L NaCl溶液，再加入1mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高纯水定容，摇匀，静置15min，按照1.2.2项下荧光发射光谱测量条件，测定待测液的荧光强度，所得结果见图4。

从图中可以看出，钠离子浓度在0～0.04mol/L区间时，随着离子浓度的升高，A组待测液的荧光强度逐渐由483.4上升到503.4，上升了20个单位，而B组待测液荧光强度则由463.4上升到493.34，上升了30个单位。这说明NaCl的存在可能不仅会影响BSA本身的荧光强度，也影响了DDAF与BSA的结合，文献[9]也报道过类似情况。同时可以看出，钠离子浓度达到0.04mol/L时，随着离子浓度的升高，A、B两组待测液的荧光强度分别基本稳定在503、493，这说明钠离子对BSA/DDAF的影响达到饱和。因此，选用0.04mol/L NaCl溶液作为适宜的钠离子强度。

2.1.4 不同酸碱度对BSA/DDAF体系荧光强度的影响

取编号为0～5的100mL容量瓶，均准确移入10mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液和40mL 0.1mol/LNaCl溶液，再分别准确移入0，10，20，30，40，50mL2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高纯水定容，摇匀，静置15min。分别准确吸取30mL止此待测液，置于A、B两组50mL烧杯中，A烧杯中适量滴加0.1mol/L HCl溶液，调节待测液pH值分别为2.7、3.7、4.7、5.7、6.7（待测液的原始pH值），B烧杯中滴加适量0.1mol/L NaOH溶液，调节待测液的pH值分别为7.4、7.7、8.7、9.7、10.7、按照1.2.2项下荧光发射光谱测量条件，分别测量待测液的荧光强度，所得结果见表2和图5。

可以看出，未加入猝灭剂的待测液中，当pH值为5.7时，BSA的荧光强度最强;当pH值在4.7～7.7范围内BSA的荧光强度大而且较为稳定;当pH值在2.7～4.7范围内，随着待测液酸性的增强，体系的荧光强度均下降;当pH为7.7～10.7范围内，随着待测液碱性的增强，体系的荧光强度也呈现同样的变化趋势，但后者的降幅比前者大。这可能是因为天然的BSA等电点为pH4.6～4.8[10-12]，而体系中加了0.04mol/L的NaCl溶液，可能使BSA的等电点升高[13]到pH5.7附近，此时BSA以分子状态存在，比较稳定，因此荧光最强，而过量的酸碱会使BSA的分子存在状态发生改变，导致荧光强度下降，并且可以看出碱性环境对于BSA荧光强度的影响较大。

当加入2.06×10^-5mol/L DDAF溶液后，在pH值为2.7、3.7、4.7、5.7、6.7时，待测液的荧光强度与未加入DDAF时的荧光强度差值分别为8.6、7.7、4.6、6.2、7.8、而当pH值为7.4、7.7、8.7、9.7、10.7时，差值分别为12.3、13.4、47.4、22.5、35.3。由此可看出碱性环境下，DDAF对于BSA的猝灭作用较强。可能是因为DDAF属于季铵盐阳离子表面活性剂，碱性环境有利于含氮阳离子部分的解离，从而增强DDAF对于BSA荧光的猝灭作用。由于pH在4.7～7.7范围内，BSA的荧光强度大而且较为稳定，又由于BSA初始pH值为6.7、在此范围之内，考虑到实验操作的简化，选择BSA的初始pH值即pH6.7为适宜的pH值。

2.2 DDAF与BSA相互作用机理的研究

2.2.1 DDAF对BSA荧光猝灭机制的研究

取A、B、C、D4组编号为0～5的10mL容量瓶，每组加入1mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液和4.0mL 0.1mol/L NaCl溶液，每组再分别加入0～5mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高纯水定容，摇匀，A、B、C、D4组分别在290.15 K、296.15K、303.15K、310.15K下保温15min，按照1.2.2项下荧光发射光谱测量条件，测定待测液的荧光强度，所得结果如表3所示。

采用Stern-Volmer方程[14]處理数据：

F₀/F=1+K_qτ₀[Q]=1+K_SV[Q]（1）式中F₀为未加入DDAF时BSA的荧光值;F为加入DDAF后BSA的荧光值;[Q]表示DDAF的摩尔浓度;K_q为双分子猝灭速率常数;τ₀表示生物大分子的平均寿命，约为1×10^-8s：K_SV表示Stern-Volmer动态猝灭常数。以F₀/F为纵坐标，[Q]为横坐标作图，结果见图6。计算不同温度下（290.15，296.15，303.15，310.15K）DDAF对BSA的动态猝灭常数，结果见表4。

常见的猝灭类型有动态猝灭和静态猝灭，静态猝灭的猝灭常数随温度升高而降低，但均大于2.0×10¹⁰L/（mol·s），动态猝灭的猝灭常数随温度的升高而增大[15]。由表4可知，在290.15K、296.15K、303.15K和310.15K下，双分子猝灭常数K_q分别为7.03×10₁₀，8.53×10¹⁰，1.09×10¹¹，1.12×10¹¹L/（mol·s），均大于2.0×10¹⁰L/（mol·s），是静态猝灭，但随温度升高，K_q值却一直上升，又是动态猝灭的现象。文献也报道过类似情况，认为是混合机制[16]，因此，DDAF与BSA的相互作用可能也是动态猝灭和静态猝灭的混合机制所致。

2.2.2 DDAF与BSA作用的结合常数、结合位点的确定

结合常数和结合位点是研究物质与BSA相互作用的重要参数。荧光强度和猝灭剂的关系可用修正的Stern-Volmer双对数方程来描述[17]，即：

1g[（F₀-F）/F]=1gK_a+nlg[Q]（2）式中F₀为未加入DDAF时BSA的荧光强度;F表示加入不同浓度DDAF后BSA的荧光强度;K_a为结合常数;n为结合位点数;[Q]为DDAF的摩尔浓度。以lg[（F₀-F）/F]对1g[Q]作图，如图7所示。由直线的斜率和截距可计算出相应的结合位点n和结合常数K_a，所得结果见表5。

由表5可知，在290.15K、296.15K、303.15K和310.15K下，结合常数的数量级在10³左右，说明DDAF与BSA的结合较弱;4个温度下的结合位点数分别为1.17、0.84、0.97、1.02，都接近1，说明DDAF与BSA的结合比为1：1。

2.2.3 DDAF与BSA相互作用力的研究

有机小分子与生物大分子的相互作用力可用如下3个热力学函数来判断：

△G=-RT1nKa（3）

△G=△H-T△S（4）

ln[K_a2/K_a1]=[1/T₁-1/T₂]△H/R（5）

计算结果见表6，由表可知，△G都小于0，说明DDAF与BSA的相互作用是在自发条件下进行的;△H和△S均大于0，表明DDAF和BSA的相互作用力是典型的疏水作用力[18]。

2.2.4 DDAF对BSA构型的影响研究

三维荧光光谱是以激发波长、发射波长、荧光强度分别为X、Y和Z轴，所得到的荧光图谱，能够更加全面反映待测品的荧光信息[19]。可以借此研究DDAF对BSA构型的影响。

取0和1号10mL容量瓶，分别准确加入1mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液和4mL 0.1mol/L NaCl溶液，并在1号瓶中加入5mL 2.06×10^-4mol/L DDAF，0和1号容量瓶均用高纯水定容，摇匀，静置15min后，用荧光分光光度计，按照1.2.2项下三维荧光光谱测量条件，测定待测液的荧光强度。所得数据见表7，待测液的三维荧光光谱见图8。

荧光峰反映了BSA中氨基酸的疏水环境[20]，由表7可知，加入DDAF后，BSA的荧光峰的强度下降了16.63%，说明DDAF对BSA分子中的氨基酸残基有影响;最大发射波长由343nm蓝移到336nm，说明DDAF的加入会使BSA分子中的氨基酸残基周围的疏水环境增强。

3 结束语

本文通过单因素实验，选定作用时间为15min;钠离子浓度为0.04mol/L;待测液的初始pH值为适宜的实验条件;并且，可以看出pH对于DDAF/BSA体系的荧光强度影响最大，钠离子的影响次之，作用时间的影响最小。在上述适宜实验条件下，进行DDAF与BSA相互作用的研究，认为DDAF对BSA荧光猝灭的机制可能为混合猝灭;二者以1：1结合;二者间的作用力是典型的疏水作用力。三维荧光光谱表明，DDAF的加入使得BSA氨基酸残基周围的疏水环境增强。

本文采用荧光光谱法和三维荧光法研究了DDAF与BSA相互作用，研究结果表明，DDAF与BSA会形成静态复合物，而且DDAF的加入使得BSA氨基酸残基周围的疏水环境增强，这些均表明DDAF的加入可能使得BSA化学结构发生变化，从而影响蛋白质的生理功能。这为 DDAF杀、抑菌作用机制的研究提供了一些有益的结论。另外，由于条件及时间有限，我们对于DDAF与BSA相互作用及研究仅仅采用了荧光光谱法及三维荧光光谱法，我们将在以后采用紫外分光光度法、同步荧光法、圆二色相光谱法等等方法来进一步研究。

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（编辑：莫婕）