巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α激活抑制巨噬细胞炎症反应诱导的心脏成纤维细胞活化及迁移*

王文伟， 王 霞， 孙艳宇， 于宝琪， 曲爱娟

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系， 重塑相关心血管疾病教育部重点实验室，代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室， 北京 100069)

高血压性心脏重塑导致的心力衰竭目前仍是全球范围内心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。心脏病理性重塑是病理刺激条件下心肌细胞、成纤维细胞和免疫细胞及其分泌的细胞因子和趋化因子之间相互作用的病理过程，主要包括心脏炎症、纤维化和肥厚等过程，而心脏纤维化是心脏重塑的主要病理改变。心脏成纤维细胞迁移到损伤部位并活化成为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞合成大量胶原导致细胞外基质沉积和胶原蛋白在间质和血管周围过多的累积，引起心肌僵硬度增加并导致心脏收缩或舒张功能障碍，加速心力衰竭进展[3-4]。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)功能失调在高血压性心脏纤维化的病理生理学过程中发挥重要作用，其中血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)是RAS系统中导致高血压性心脏纤维化最重要的效应分子[5-6]。既往研究表明，Ang II刺激后的心脏组织招募大量的外周单核/巨噬细胞，激活的单核/巨噬细胞释放大量炎症细胞因子和趋化因子，加剧心脏炎症和纤维化，加速心力衰竭的进程[7]。巨噬细胞在心脏纤维化重塑中发挥着重要作用[7]。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)是过氧化物酶体增殖物激活受体家族的主要成员，内源性配体主要是非饱和脂肪酸，外源性配体包括WY14643和贝特类药物。PPARα具有重要的抗炎和抗氧化应激作用，可减轻心脏梗死或损伤后炎症反应[8-9]，但是巨噬细胞PPARα在心脏纤维化中的作用目前尚不清楚。因此，本文将研究巨噬细胞PPARα在巨噬细胞炎症反应诱导的心脏成纤维细胞活化和迁移过程中的作用。

材 料 和 方 法

1 实验动物

8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物操作均遵循首都医科大学实验动物管理条例，实验方案得到首都医科大学实验动物保护与伦理委员会的审核批准。

2 细胞

小鼠巨噬细胞和心脏成纤维细胞分别从8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠的骨髓和心脏中分离培养所得。

3 主要试剂

胰酶(#85450C-100G)和胶原酶II(#C6885-5G)购自Sigma；DMEM培养基(#10-013-CVR)和胎牛血清(#SH30406.02HI)购自Corning；D-Hanks液(#H1045-500)和青、链霉素(#P1400)购自Solarbio；PBS(#SH30256.01B,HyClone)；巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF; #315-02，PeproTech)；血管紧张素Ⅱ(#ab120183，Abcam)；WY14643(#A4305，MCE)；反转录试剂盒(#A5001，Promega)；SYBR Green(#RR420A，TaKaRa)；RIPA裂解液(#C1053+)和脱脂奶粉(#P1622)购自普利莱；蛋白酶抑制剂HaltTMProtease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific)；PVDF膜(#ISEQ00010,Immobilon)；、抗β-actin单克隆抗体(#ab8266，Abcam)；抗白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)多克隆抗体(#bs-4539R,BIoss)；抗collagen I多克隆抗体(#14695-1-AP)和抗collagen III多克隆抗体(#22734-1-AP)购自Proteintech；抗IL-β单克隆抗体(#12242)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)单克隆抗体(#48938)、羊抗兔IgG II抗(#7074)和羊抗小鼠IgG II抗(#7076)购自Cell Signaling Technology；RT-qPCR引物购自Sangon Biotech，序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

Acta2: actin alpha 2, encoding α-SMA; Col1a2: collagen type Ⅰ alpha 2 chain; Col3a1: collagen type Ⅲ alpha 1 chain.

4 实验方法

4.1鼠骨髓巨噬细胞的培养及实验分组 常规方法从小鼠胫骨和股骨中分离提取小鼠骨髓细胞，使用M-CSF(50 μg/L)诱导3 d使之分化为成熟的巨噬细胞后进行实验[7]。将分化的巨噬细胞随机分为4组：对照(control)组、WY14643组(10 μmol/L处理30 h)、Ang II组(1 μmol/L刺激24 h)和Ang II+WY14643组(10 μmol/L WY14643预处理6 h后给予1 μmol/L Ang II刺激24 h)。

4.2小鼠心脏成纤维细胞的分离培养及实验分组 酶消化法(0.07%胰酶和0.04%的胶原酶II的混合酶)分离小鼠心脏成纤维细胞，培养并使用第2代心脏成纤维细胞进行实验[10]。心脏成纤维细胞随机分为4组，分别给予上述巨噬细胞的条件培养基继续培养24 h。

4.3心脏成纤维细胞划痕实验 使用无菌枪头在6孔板的细胞中由上而下以均匀的力度划一条直线，用PBS 清洗掉细胞残片，拍照后加入上述4组巨噬细胞条件培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h，然后结晶紫染色后拍照[10]。使用ImageJ软件统计划痕区域迁移的细胞数目。

4.4总RNA提取和RT-qPCR实验 利用TRIzol有机溶剂抽提法提取细胞总RNA，测量浓度及质控指标后利用反转录试剂盒将2 μg RNA反转为cDNA。利用Bio-Rad CFX Connect Real-time System PCR仪进行real-time PCR获得可靠的扩增曲线后，以β-actin为内参照，通过ΔΔCt法进行相对定量，即目的基因相对表达量= 2-ΔΔCt[ΔΔCt=(实验组目的基因Ct-相对应的内参Ct)-(对照组目的基因Ct-相对应的内参照Ct)]。

4.5总蛋白提取和Western blot实验 利用RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白，蛋白变性后，经SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后，孵育I抗和II抗，利用化学发光法显色发光，随后使用ImageJ 进行吸光度值分析。

5 统计学处理

用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示。首先要评估数据是否为正态分布，然后进行正态分布数据的方差齐性检验，方差齐的两组数据采用非配对t检验，多组数据的单因素比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 Ang Ⅱ处理可下调巨噬细胞中PPARα的表达

体外给予巨噬细胞Ang II处理24 h后，RT-qPCR检测巨噬细胞中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-1α mRNA水平以及PPARα mRNA水平的改变。结果显示Ang Ⅱ明显升高巨噬细胞炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平(P<0.01)，同时显著降低巨噬细胞中PPARα的mRNA水平(P<0.05)，见图1。以上结果提示PPARα可能在Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应中发挥重要作用。

2 激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症因子表达

体外给予巨噬细胞PPARα激动剂WY14643处理后，观察巨噬细胞炎症因子的表达。RT-qPCR结果显示，WY14643可显著降低Ang II诱导的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平(P<0.05)，见图2A～C。Western blot结果显示WY14643也显著降低Ang II诱导的巨噬细胞促炎因子pro-IL-1β和IL-6的蛋白水平(P<0.05)，见图2D。这提示激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症因子的表达。

Figure 1.Ang II induced macrophage inflammatory response and significantly down-regulated PPARα expression. Macrophages were treated with Ang II for 24 h. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of IL-6 (A), IL-1β (B), TNF-α (C) and PPARα (D) in the macrophages. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1 Ang II 诱导巨噬细胞炎症反应的同时显著下调PPARα的表达

3 激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应对心脏成纤维细胞的活化

用上述巨噬细胞的培养上清液培养心脏成纤维细胞24 h，RT-qPCR检测结果显示，WY14643和Ang II联合处理的巨噬细胞条件培养基降低心脏成纤维细胞纤维化标志物Col1a2、Col3a1和Acta2的mRNA水平(P<0.05)，Western blot实验结果显示WY14643和Ang II联合处理的巨噬细胞条件培养基降低心脏成纤维细胞中collagen I、collagen III (P<0.01)和α-SMA的蛋白水平(P<0.05)，见图3。这提示激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应对心脏成纤维细胞的活化。

4 激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应对心脏成纤维细胞迁移的促进作用

对心脏成纤维细胞进行划痕实验后，随机加入上述4组巨噬细胞的条件培养基，结果显示Ang II处理的巨噬细胞条件培养基显著增强心脏成纤维细胞的迁移(P<0.01)，而PPARα激动剂WY14643联合Ang II处理后的巨噬细胞条件培养基明显抑制心脏成纤维细胞的迁移(P<0.01)，见图4。这提示PPARα激活可能通过减轻Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞炎症反应抑制心脏成纤维细胞的迁移。

讨 论

我们的研究结果显示Ang II诱导巨噬细胞炎症反应的同时显著下调PPARα，而PPARα激动剂WY14643可以显著减轻Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应。Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应可显著促进心脏成纤维细胞的活化和迁移，而PPARα激动剂WY14643可通过减轻Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应，抑制心脏成纤维细胞的活化和迁移，从而提示巨噬细胞PPARα可能在免疫细胞参与的心脏纤维化过程中发挥重要的抑制作用。

既往研究表明，免疫炎症反应在高血压心脏纤维化中发挥重要作用[11]，其中单核细胞和心脏常驻巨噬细胞是心脏组织修复的关键调节者。巨噬细胞通常分为经典激活的巨噬细胞(M1)和非经典激活的巨噬细胞(M2)两型，分别发挥促炎和抗炎作用[11]。组织损伤后的初期，以M1型为主的心脏常驻巨噬细胞会分泌大量促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和趋化因子，从外周招募大量单核细胞迁移到损伤部分，并促进这些单核细胞转化为M1型促炎巨噬细胞，加剧心脏炎症反应[7, 12]。巨噬细胞可通过分泌炎症细胞因子、趋化因子和生长因子，以及改变细胞外基质转化和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和MMP组织抑制剂平衡的方式，调节成纤维细中细胞外基质的生成，调节心脏纤维化[7, 13]。我们的研究表明Ang II显著增加巨噬细胞促炎因子的表达，而且巨噬细胞激活后的条件培养基明显增加心脏成纤维细胞纤维化标记物的mRNA和蛋白水平，这进一步证实了Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应促进成纤维细胞的活化。

Figure 2.PPARα activation inhibited Ang II-induced expression of inflammatory cytokines in the macrophage. The macrophages were treated with WY14643 (10 μmol/L) and Ang II (1 μmol/L). RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of IL-6 (A), IL-1β (B) and TNF-α (C) in the macrophages. Western blot was used to detect the protein levels of pro-IL-1β and IL-6 in the macrophages (D). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAng II group.

图2 激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症因子的表达

Figure 3.Activation of PPARα inhibited macrophage (Mφ) inflammation-induced cardiac fibroblast activation. Cardiac fibroblasts were stimulated with the conditioned medium (CM) derived from the macrophages. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of Col1a2 (A), Col3a1 (B) and Acta2 (C) in the cardiac fibroblasts. Western blot was used to determine the protein levels of collagen I, α-SMA and collagen III in the cardiac fibroblasts (D and E). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol Mφ CM group;#P<0.05,##P<0.01vsAng II Mφ CM group.

图3 激活PPARα可抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应对心脏成纤维细胞的活化

Figure 4.PPARα activation inhibited the migration ability of cardiac fibroblasts promoted by Ang II-induced macrophage inflammation. Wound-healing assay was applied to evaluate the migration ability of cardiac fibroblasts, and samples were photographed at 0 h and 6 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol Mφ CM group;##P<0.01vsAng II Mφ CM group.

图4 PPARα激活抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应对心脏成纤维细胞迁移的促进作用

PPARα除了在脂肪酸β氧化水平高的组织中广泛表达，也在单核/巨噬细胞等免疫细胞中表达[14-15]。既往报道激活后的PPARα可以负性调控促炎转录因子NF-κB、AP-1和STAT的活性发挥抗炎作用[16]。WY14643是PPARα的外源性配体，在无配体结合时，PPARα和RXR形成的异源二聚体与转录共抑制因子结合，当配体与PPARα结合后，PPARα和RXR形成的异源二聚体与转录共激活因子结合形成的复合物与靶基因启动子上的PPAR反应元件结合，启动下游靶基因的转录[16]。WY14643可促进巨噬细胞向M2型转换，降低 NOS-2和促炎细胞因子的表达，并增加M2型巨噬细胞标记物表达[17]。我们的研究结果发现PPARα激动剂WY14643明显减轻Ang II诱导的巨噬细胞炎症，而且炎症水平减轻的巨噬细胞培养上清抑制心脏成纤维细胞纤维化标志物的表达。这说明PPARα激活抑制Ang II诱导的巨噬细胞炎症因子的表达，而且间接抑制心脏成纤维细胞活化和迁移。

既往研究表明巨噬细胞可以通过分泌的细胞因子和趋化因子激活成纤维细胞内的TGFβ1/Smad2/3信号通路[7]，也可通过损伤信号分子激活成纤维细胞p38-MAPK非经典信号通路促进心脏纤维化[18]。但是PPARα激活导致巨噬细胞炎症水平降低的机制以及巨噬细胞炎症介导心脏成纤维细胞活化的具体机制都需在巨噬细胞特异性敲除PPARα小鼠、体外骨髓源性巨噬细胞和心脏成纤维细胞上进一步探究。

综上所述，我们的研究发现Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应可促进心脏成纤维细胞的活化和迁移，且PPARα激活抑制了Ang II诱导的巨噬细胞炎症反应对心脏成纤维细胞活化和迁移的促进作用。