有机硒通过下调AR及PSA抑制激素非依赖性前列腺癌细胞生长*

杨丽娟， 葛 贺， 安丽萍， 孙 新， 郭 鹏， 刘 杰， 林珈羽， 刘艳波△

(北华大学 1医学院病理生理学教研室， 2吉林省分子老年医学重点实验室， 3药学院微生物与生化药学教研室， 吉林 吉林 132013； 4北华大学附属医院肾病风湿病科， 吉林 吉林 132011)

1941年美国芝加哥大学的Huggins和Hodges最先报道了切除双侧睾丸(去势，castration)在转移性前列腺癌患者中的良好疗效，奠定了内分泌治疗前列腺癌的基础[1]。去势主要降低雄激素的含量，但由于雄激素合成及代谢的复杂性，单纯去势治疗不能完全阻断体内雄激素，这是因为肾上腺网状带产生的双氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)不会因去势而消失[2]。DHT作用强大，其生物效应是生殖组织的1.5～2.5倍；而且，DHT与雄激素受体(androgen receptor，AR)的结合能力要比睾酮(testosterone，T)大4～5倍。DHT与AR结合后，激活雄激素下游基因，进而控制前列腺细胞增殖和分裂，使得激素依赖性前列腺癌(hormone-dependent prostate cancer，HDPC)最终发展成激素非依赖性前列腺癌(hormone-independent prostate cancer，HIPC)[3]。因此，延缓HIPC发生发展，延长患者生存期，具有重要的现实意义。

硒是人体必需的微量元素，具有明显免疫增强效应，对前列腺癌的预防及治疗效果显著。但无机硒化物在低浓度时即表现细胞脱壁、细胞内空泡增多、细胞膜破裂、细胞坏死和急性溶解等毒性作用[4]；而有机硒具有防治前列腺癌的效应，如每天补充200 μg的硒可使前列腺癌的发病危险性降低50%；含硒化合物可抑制LNCaP、PC-3和DU145细胞的增殖[5-6]。Dong等[7]发现，甲基化硒酸(methyl-seleninic acid，MSA)可抑制AR与雄激素受体反应原件(androgen receptor element，ARE)的结合，干扰雄激素信号转导效应，从而降低前列腺癌的发病率或延迟HIPC的发生[8]。

因此，本文通过体外实验观察MSA对 LNCaP抑制作用并探讨相关机制，进而通过裸鼠前列腺癌去势后复发模型，探讨甲基硒代半胱氨酸(methylselenocysteine，MSC)延缓HIPC的作用及相关机制，为前列腺癌靶向辅助治疗奠定基础。

材 料 和 方 法

1 细胞株及动物

HDPC细胞株LNCaP由吉林大学前列腺癌防治研究中心赵雪俭教授馈赠；用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，0.25%胰酶消化传代。10只BALB/c-nu/nu雄性裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，4～6周龄，体重18～20 g，于恒定温度(22～25 ℃)、恒定湿度(40%-50%)的SPF层流室中饲养，标准饲料及水经高压灭菌后供动物自由食用，该动物研究符合国际公认标准，并得到了北华大学医学院动物伦理委员会的批准。

2 主要试剂

MSA和MSC由美国杜兰大学张海涛博士惠赠(Sigma)；DNA marker DL2000和DNA marker DL15000购自TaKaRa；溴化乙锭、琼脂糖、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、MTT、DTT、DMSO、PE-Texas Red和PMSF购自Sigma；DEPC购自Merck；高保真Taq DNA聚合酶、DAB、Triton X-100、dNTP和MMV逆转录酶购自Promega；TRIzol购自Invitrogen；胰酶、IMDM培养基和胎牛血清购自HyClone；其它常规化学试剂均为进口或国产分析纯产品。鼠抗人AR、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)和信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)多克隆抗体及碱性磷酸酶与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体购自santa Cruz；PSA试剂盒购自CanAG；兔抗人β-actin多克隆抗体和TUNEL原位杂交试剂盒购于武汉博士德公司。

3 主要仪器

PCR扩增仪(GeneAmp)；倒置相差显微镜和荧光显微镜(Olympus)；超净工作台(YZ-875苏州净化设备厂)；自动CO2恒温培养箱(SANYO)；电泳仪、蛋白质电泳装置及转移系统(Bio-Rad)；凝胶成像系统(Tanon)；紫外分光光度计及分析工作站(Shimadazi)。

4 主要方法

4.1LNCaP细胞的培养及生长抑制实验 将LNCaP细胞分为4组：即对照(mock)组、MSA低剂量(1.25 μmol/L)组、MSA中剂量(2.50 μmol/L)组和MSA高剂量(5.00 μmol/L)组。当培养的贴壁细胞达到70%融合时，分组加药，设立24 h、48 h和72 h 3个时点，预定时段每孔加入50 μL经4 ℃预冷的500 mL/L三氯醋酸，使终浓度为100 mL/L，置4 ℃放置1 h，自来水充分漂洗，空气干燥后，加4 g/L磺酰罗丹明B(sulforhodamine B, SRB)染色15～30 min，醋酸洗涤、干燥，加入10 mmol/L Tris液100 μL溶解，微振器上振荡10 min，酶联检测仪上于波长570 nm处测吸光度(A)值。抑制率(%)=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值×100%。

4.2流式细胞术检测凋亡 将加药处理后的细胞快速推入70%冷乙醇中，4 ℃固定12 h，用RNase消化后，加入1.5 mL PE-Texas Red (75 mg/L)对DNA进行染色，细胞混匀后在流式细胞仪上进行单参数分析。

4.3RT-PCR法检测AR、PSA和STAT3的mRNA表达 根据PCR引物设计原则，设计人源性AR、PSA、STAT3和β-actin的引物序列，见表1。采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法计算提取的总RNA含量及浓度。参照OneStep RT-PCR试剂盒实验操作说明进行RT-PCR，总反应体积50.0 μL： 5× OneStep RT-PCR buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5× Q-Solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。扩增条件为： 50 ℃ 逆转录30 min、95 °C初始化15 min；94 °C变性 1 min、55 ℃ ～57 ℃ 1 min、72 °C 1 min，28～30个循环；72 ℃ 10 min。在2%琼脂糖凝胶上电泳，70 V、 40 min，凝胶图像成像系统拍摄保存实验结果，凝胶图像分析系统(GelPro Analyzer 3.0)分析各目的基因与β-actin条带吸光度值。

表1 RT-PCR的引物序列

4.4Western blot法检测AR、PSA和STAT3蛋白的表达 取蛋白50 μg加入等体积2×上样缓冲液，于100 ℃沸水中热变性10 min，上样。电泳结束后经Bio-Rad半干式转膜60 min，blocking buffer(5%脱脂奶粉)室温封闭2 h。TBST洗膜，鼠抗人PSA(1 ∶300)和AR(1 ∶500) 抗体稀释溶于TBST中，4 ℃与膜孵育过夜，TBST洗膜；加入1 ∶300稀释的生物素标记的羊抗小鼠IgG II 抗，室温孵育60 min，TBST洗膜；再加入辣根过氧化物酶标记的III抗，室温孵育60 min，TBST洗膜。加入DAB显色，待特异性条带信号清晰可见时用stop buffer终止染色。采用天能科技有限公司GIS凝胶图像分析系统处理相关信号。

4.5免疫荧光染色 各组细胞于加药48 h后用PBS清洗，新鲜配制的4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS充分洗涤，0.2% Triton X-100打孔10 min，PBS洗后1%BSA室温孵育15 min，封闭非特异性位点；滴加STAT3多克隆抗体(1 ∶300)室温孵育2 h，2.7% NaCl 洗涤后PBS清洗；滴加CY3标记的荧光 II 抗(1 ∶20由1%PBS BSA配制)避光室温孵育细胞1 h，荧光显微镜下观察，拍照。

4.6免疫细胞化学染色 6孔培养板内接种5×105细胞，37 ℃、5% CO2中培养，次日加药，继续培养48 h，PBS清洗，迅速经4%多聚甲醛的固定液中于 4 ℃固定过夜，0.2% Triton X-100处理10 min，并用封闭液封闭1 h。然后分别用抗STAT3抗体(1 ∶500)4 ℃孵育24 h。用PBS 洗3遍后，用Cy3标记山羊抗兔IgG(1 ∶500)在室温下进行染色标记、观察。细胞图像通过显微镜用 ×10或 ×20物镜摄取。每组独立的实验都会采集超过30个区域的细胞。而且，在明视野下所采集的每幅图像都尽量包含相同的细胞数目。应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析各实验组的荧光图片单个细胞的累积吸光度值，进行统计学分析。

4.7裸鼠移植瘤动物模型的建立 将LNCaP 细胞用胰酶消化成细胞悬液，离心，将细胞团块混合于Matrgel(4 ℃)中，取LNCaP 细胞1×107个接种于裸鼠背部皮下。待移植瘤长至直径10 mm时将瘤无菌条件下取出，分成直径约2 mm×2 mm的瘤块，裸鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，强力碘消毒皮肤，将瘤块植入10只裸鼠背部皮下，缝合。密切观察肿瘤生长情况，待肿瘤长到5 mm时，切除睾丸，进行手术去势。

4.8裸鼠前列腺癌去势模型的建立 10只裸鼠重新麻醉，消毒下腹部，垂直腹中线在阴囊处打开切口，切除睾丸，结扎睾丸动脉，缝合皮肤。将裸鼠随机分为2组，每组5只，去势组即日起每天MSC灌胃，MSC的剂量为每天5 μg/g，对照组给予生理盐水200 μL灌胃，连续给药16周。

4.9一般指标观察 密切观察裸鼠生活变化，每周测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，根据公式 V=L×W2×0.52计算肿瘤体积，绘制肿瘤的生长曲线。实验毕，全麻法处死小鼠，完整分离肿瘤，称瘤重，游标卡尺测量肿瘤长径和短径并计算体积，观察是否有淋巴结转移情况等；肿瘤组织固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察形态变化。同时分离血清进行PSA含量测定。

4.10TUNEL法检测肿瘤组织的细胞凋亡 肿瘤组织10%福尔马林固定48 h，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水。新鲜配制3% H2O2封闭10 min。切片滴加Proteinase K缓冲液37 ℃消化15 min。TdT和DIG-dUTP各1 μL加入18 μL标记缓冲液中，混匀，与组织共孵育，37 ℃标记2 h。TBS清洗后加封闭液，室温孵育30 min。用封闭液1 ∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，每片50 μL。37 ℃反应30 min。TBS清洗后滴加SABC，继续反应60 min。TBS清洗，DAB显色。水洗，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。细胞核染为棕黄色的即是凋亡细胞，每张切片观察3个视野，每个视野连续数300个细胞，计数凋亡细胞百分比即为凋亡指数(apoptotic index, AI)。AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

4.11ELISA测定血清PSA的含量 10只裸鼠于接种肿瘤前、去势前、去势后1周分别眼眶取血进行血清PSA含量的测定。将PSA抗体包被的微孔固定到支架上；在微孔中加入25 μL对照标准品或血清试样；加入100 μL酶结合物(空白组不加)；室温下孵育30 min；去除温育混合物，用配置好的清洗液清洗微孔；在每个微孔中依次加入100 μL显色液A和显色液B(包括显色液空白组)。室温孵育10 min；每个微孔中加入50 μL终止液；通过微孔反应板酶标仪，在波长450 nm处读取吸光度(A)值。

5 统计学处理

用SPSS 11.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MSA抑制LNCaP细胞生长

在预定时点检测细胞的生长情况，以mock组的生长抑制率为0%，给药24 h、48 h和72 h后，1.25、2.50和5.00 μmol/L MSA组细胞的生长抑制率随药物浓度的增加而增加，依培养时间延长而增加，表现出明显的时间和剂量依赖关系(P<0.05)，见表2。

表2 MSA对LNCaP细胞生长的影响

Table 2.Effect of MSA on the growth of LNCaP cells (Mean±SD.n=4)

GroupGrowth inhibitory rate (%)24 h48 h72 hMock0001.25 μmol/L 1.24±0.285.36±1.569.21±2.882.50 μmol/L 9.23±3.7221.62±9.21∗39.42±4.87∗#5.00 μmol/L 18.36±2.96∗#30.67±7.73 ∗#65.32±12.11∗#

*P<0.05vsmock group;#P<0.05vs1.25 μmol/L group.

2 MSA对LNCaP细胞周期分布及凋亡的影响

LNCaP细胞经1.25、2.50和5.00 μmol/L MSA处理48 h后，快速推入70%冷乙醇中，4 ℃固定，RNase消化后用PE-Texas Red溶液对DNA进行染色，用流式细胞术进行单参数分析，结果显示随MSA浓度增大，细胞凋亡率随着增加，且细胞主要停滞在G0/G1期,见图1、表3。

Figure 1.Apoptosis and cell cycle of LNCaP cells treated with MSA at different doses.

图1 MSA对LNCaP细胞凋亡和细胞周期的影响

表3 MSA对LNCaP细胞凋亡和细胞周期的影响

Table 3.Apoptosis and cell cycle analysis in the LNCaP cells treated with MSA (%. Mean±SD.n=3)

GroupApoptotic cellsG0/G1SMock 0.90±0.65 39.90±2.53 56.70±6.27 1.25 μmol/L MSA 14.70±1.45∗ 46.20±2.36 28.70±4.73∗ 2.50 μmol/L MSA 33.10±2.36∗ 53.30±3.19∗44.90±5.38∗ 5.00 μmol/L MSA52.80±2.87∗∗#68.80±3.64∗# 24.30±4.56∗

*P<0.05,**P<0.01vsmock group;#P<0.05vs1.25 μmol/L MSA group.

3 MSA对AR及PSA mRNA表达的影响

与mock组相比，不同浓度的MSA作用于LNCaP细胞48 h后PSA及AR的mRNA表达明显降低(P<0.05)，以5.00 μmol/L MSA组最为明显,见图2。

Figure 2.The mRNA expression of AR and PSA in the LNCaP cells treated with MSA at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmock group.

图2 MSA对LNCaP细胞AR及PSA mRNA表达的影响

4 MSA对AR及PSA 蛋白表达的影响

与mock组相比，2.50 μmol/L和5.00 μmol/L浓度的MSA与LNCaP孵育48 h明显降低LNCaP细胞内AR及PSA 蛋白的表达(P<0.05)，见图3。

5 MSA对LNCaP细胞STAT3表达的影响

利用免疫荧光法检测LNCaP细胞内STAT3的表达与定位，结果显示mock组STAT3阳性的红色荧光位于胞浆及胞核，5.00 μmol/L MSA处理后LNCaP细胞 STAT3阳性的红色荧光数量明显减少，强度明显降低,见图4。

Figure 3.The protein expression of AR and PSA in the LNCaP cells treated with MSA at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmock group.

图3 MSA对LNCaP细胞AR及PSA蛋白表达的影响

免疫细胞化学染色发现，mock组细胞增殖旺盛，STAT3蛋白的阳性表达颗粒主要位于胞浆，也有少部分位于胞核内，而5.00 μmol/L MSA组STAT3蛋白表达明显下降，见图4。

Figure 4.STAT3 expression in the LNCaP cells treated with MSA observed by immunofluorescence (A) and immunocytochemical (B) methods (×200).

图4 免疫荧光及免疫细胞化学法检测STAT3表达

6 MSC对裸鼠移植瘤生长的影响

裸鼠接种瘤块20 d后，10只裸鼠全部出瘤，瘤体积平均为(172.56±20.36) mm3，切除睾丸进行去势，mock组每天200 μL生理盐水灌胃，治疗组每天5 μg/g MSC灌胃，连续给药16周，实验期间裸鼠肿瘤的生长曲线见图5，由该生长曲线可知，去势后2组动物的肿瘤体积均明显回缩，表现良好的治疗效果。mock组动物移植瘤从第8周开始生长加快，接近去势之前水平。而MSC组第11周肿瘤体积达到去势前水平，说明MSC有延缓去势后前列腺癌生长的作用，从第13周开始，两组动物移植瘤体积的差异存在统计学意义(P<0.05)，见图5。第16周时处死动物，见图 6，取移植瘤测量体积并称重，与mock组相比，MSC治疗组移植瘤重量明显减轻(P<0.05)，体积明显减小(P<0.05)，见图7。

7 MSC对PSA分泌的影响

于接种肿瘤前、去势前和去势1周后眶内用毛细管采血，治疗16周后断头取血，分别进行PSA含量测定。结果显示，正常雄性裸鼠PSA含量低，接种LNCaP细胞后PSA分泌增加，去势前PSA含量明显高于接种细胞前，去势1周后PSA水平迅速下降(P<0.05)，说明去势干扰PSA合成与分泌；MSC治疗16周后PSA增加，但MSC组增加缓慢，与同期mock组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

Figure 5.The tumor growth curve of the nude mice treated with MSC after castration. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsmock group.

图5 MSC对裸鼠皮下移植瘤去势后生长的影响

Figure 6.The LNCaP cell xenografts in the nude mice treated with MSC after castration.

图6 去势16周后裸鼠前列腺癌皮下移植瘤生长情况

Figure 7.The weight and volume of the xenografts in the nude mice treated with MSC for 16 weeks after castration. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsmock group.

图7 MSC对裸鼠前列腺癌皮下移植瘤体积及重量的影响

表4 MSC治疗前后裸鼠血清PSA水平的变化

*P<0.05vsbefore inoculation;#P<0.05vsbefore castration;▲P<0.05vsmock at killed time.

8 MSC对肿瘤细胞凋亡的影响

TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况，结果显示mock组的细胞生长旺盛，细胞核大而深染，凋亡细胞少，而MSC治疗组的肿瘤组织内细胞数量明显减少，结构疏松，肿瘤细胞生长不够旺盛，可见大量细胞核染为棕黄色的凋亡细胞，MSC组凋亡指数明显高于mock组(P<0.05)，见图8、表5。

Figure 8.The apoptosis in the xenografts of the mice treated with MSC for 16 weeks. A: mock group; B: MSC group (×400).

图8 MSC对前列腺癌皮下移植瘤细胞凋亡的影响

表5 MSC对前列腺癌皮下移植瘤细胞生长及凋亡的影响

Table 5.The effects of MSC on viability index (VI) and apoptotic index (AI) of the xenografts in nude mice (Mean±SD.n=5)

Group AI (%)VI (%)Mock 4.93±1.6292.64±9.25MSC52.60±10.67∗∗54.80±7.64∗

*P<0.05,**P<0.01vsmock group.

9 MSC对相关基因mRNA表达的影响

RT-PCR结果可见MSC可明显抑制AR、PSA及STAT3的mRNA水平(P<0.05)，见图9。

Figure 9.The relative mRNA levels of AR, PSA and STAT3 in the LNCaP cell xenografts after castration and treated with MSC.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock group.

图9 MSC对前列腺癌移植瘤相关基因mRNA表达的影响

10 MSC对相关蛋白水平的影响

提取肿瘤组织总蛋白及核蛋白进行Western blot分析，结果显示,与mock组相比，MSC组的STAT3、PSA和AR蛋白水平明显下调(P<0.05)，见图10。

Figure 10.The relative protein levels of AR, PSA and STAT3 in the LNCaP cell xenografts after castration of the mice treated with MSC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock group.

图10 MSC对前列腺癌移植瘤相关蛋白表达的影响

讨 论

AR在全身各组织均存在，但主要位于前列腺上皮细胞及部分基质细胞中[9]。AR的改变在前列腺癌发生、发展中作用以及与内分泌治疗的关系受到研究者的广泛关注。HDPC仍稳定表达AR，其在HIPC进展过程中不但没有消失，通过抗雄激素治疗后反而有基因扩增现象。前列腺癌细胞通过AR异常增加来适应较低水平的血清雄激素，使细胞对低浓度雄激素的敏感性增加，进而发展成为HIPC，成为抗雄激素治疗失败的原因之一。

本研究发现，MSA体外具有抑制前列腺癌LNCaP细胞生长的作用，通过分子生物学手段证实，MSA抑制前列腺癌LNCaP细胞AR表达，使得雄激素与受体结合量减少，对前列腺癌生长的支撑作用减弱，延缓癌细胞的生长甚至造成前列腺癌细胞凋亡。

PSA是由前列腺上皮细胞分泌的单链糖蛋白，具有糜蛋白酶活性。PSA存在于正常和前列腺癌组织、前列腺液和精液中，而精液中的浓度很高，血清中的浓度很低。血清中的PSA呈结合与非结合两种形式出现[10]，大多数血清PSA与蛋白酶拮抗剂如α1-抗糜蛋白酶或α2-巨球蛋白结合，血清结合的PSA占多数，游离的仅占10%～20%。当肿瘤细胞破坏由内皮层、基底细胞层和基底膜构成的屏障时，腺泡内容物即可进入血循环，导致外周血PSA水平升高。PSA具有较高的组织特异性，PSA在血清中的含量与疾病的发展阶段相关，可及时反映前列腺癌患者的治疗情况[11]。Zhang等[12]将MSA加入LNCaP细胞培养液中，利用基因芯片发现，多种细胞周期调控基因的mRNA表达水平发生了剧烈变化，同时细胞增殖受抑，细胞大量积聚在G0/G1期，同时抑制雄激素受体的表达并降低PSA的分泌量。本研究体外实验结果表明，MSA具有下调PSA表达的效应，其机制与MSA下调AR表达，使得雄激素与AR的结合减少，短期内减弱对下游基因的调节功能，使PSA的表达降低，癌细胞增殖作用减弱，生长抑制效应增强，并出现明显细胞凋亡现象，为含硒药物治疗前列腺癌的应用奠定了坚实基础。

为了证实含硒药物对前列腺癌生长的影响，本研究构建了裸鼠前列腺癌皮下移植瘤去势后复发模型。LNCaP细胞接种到裸鼠背部皮下可成瘤，说明HDPC构建成功。待肿瘤生长至一定体积后进行去势，肿瘤生长迅速回缩，证实移植瘤对雄激素剥夺治疗的敏感性，此时动物体内PSA含量降低，进一步证实去势治疗的有效性。待去势发生后8周，肿瘤重新出现，说明去势治疗前期有效，而后出现肿瘤复发，一般为HIPC。但MSC治疗组肿瘤复发时间延后，肿瘤体积明显小于相应时段mock组体积，说明MSC具有延缓HIPC发生发展作用。体外研究成果显示，有机硒一方面干扰PSA的合成，一方面降解PSA，使血中PSA的水平降低，从而抑制前列腺癌的生长。而利用LNCaP细胞复制前列腺癌裸鼠模型，每日给小鼠腹腔注射MSC，发现MSC处理后小鼠肿瘤明显变小且肿瘤组织内AR受体减少，血中PSA浓度降低，说明含硒化物在体内也可以发挥抑制肿瘤生长的作用。本实验在预定时间处死动物，两组动物血清中PSA含量均增加，但MSC可延缓血清中PSA的增加速度和水平，同时移植瘤的生长速度缓慢；RT-PCR和Western blot实验结果显示，MSC组动物肿瘤组织PSA及AR的mRNA转录水平下降及蛋白表达均较mock组明显降低，免疫组织化学染色结果证实，去势后mock组动物肿瘤组织AR的表达量及强度均降低，说明MSC可干扰AR表达的某些环节。根据前期的研究结论：硒既可干扰AR的转录，又干扰AR与ARE的结合，从而阻断了AR的信号转导，导致下游基因PSA等的转录及翻译受到抑制，进而预防前列腺癌的发生或延缓(抑制)AIPC的产生。

为了探讨MSC延缓去势后HIPC发生的机制，本研究利用RT-PCR、Western blot和组织学等技术检测了MSC对STAT3表达影响，结果显示MSC可下调STAT3 的mRNA及蛋白表达，与mock组比较差异有统计学意义。STAT3是转录信号传导子与激活子家族的重要成员，受IL-6、EGF、PDGF和CSF-I等调节，这些细胞因子与细胞膜表面受体相互作用激活JAK-STAT途径发挥调节细胞生长作用。在前列腺癌的发生发展中，STAT3作用独特，它可通过替代机制激活AR，AR与配体T靶向结合，促进HIPC的发生及进展。如IL-6可作为HIPC自分泌/旁分泌因子，保护癌细胞逃逸抗肿瘤药物的细胞毒性作用；IL-6与其受体结合后，激活JAK旁路，使STAT3磷酸化，进而与凋亡及增殖相关基因启动子结合，诱导靶基因转录与过度表达，调控细胞增殖与凋亡等[13-15]。此外，Kok等[16]发现，硒可干扰正常前列腺上皮-间质转化，在预防前列腺癌发生中发挥重要作用。本研究结果显示，mock组肿瘤组织的STAT3表达增强，细胞生长活跃，血管形成丰富，而MSC降低STAT3的表达，表现出大量的凋亡细胞，细胞增殖不明显。另外，MSC可通过降低STAT3的表达而延缓HIPC发生。

从本研究的结果可知，MSA体外通过干扰AR、PSA和STAT3的表达而抑制LNCaP细胞生长，并促进其凋亡，通过构建裸鼠前列腺癌去势后复发模型发现：MSC体内可抑制去势后的前列腺癌生长，并降低血清中PSA的含量，延迟HIPC发生，其主要机制可能一是MSC可干扰AR的信号转导，抑制PSA的分泌而起到抑制肿瘤生长的作用；二是MSC可下调STAT3的表达，结合我们前期研究工作[17]，MSC可通过抑制肿瘤血管形成，实现抑制前列腺癌生长的目的，为临床前列腺癌的辅助治疗提供新的思路。

本研究成功复制裸鼠前列腺癌去势后复发模型；有机硒可延缓HIPC的发生，硒联合去势治疗前列腺癌具有广阔前景。