缺氧条件下沉默DEC1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活力、侵袭及迁移的影响*

薛 璟， 鲍红光， 郑立红， 何 兰， 代云峰， 赵大龙， 潘洪明△， 李国锋△

(齐齐哈尔医学院 1医学技术学院, 2基础医学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

缺氧是肿瘤微环境的一个重要特征，现已被证实在肺癌、乳腺癌和肝癌等诸多实体瘤肿瘤细胞的增殖、浸润与转移等多种恶性生物学行为的发生过程中发挥着重要作用，缺氧越严重，肿瘤的预后越差[1-3]。因此，针对缺氧微环境的深入研究，有助于进一步了解肿瘤的生长特性，对肿瘤的诊疗具有重大意义。

胚胎软骨发育基因1(differentiated embryonic chondrocyte gene 1, DEC1)属于碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)类转录因子家族成员，其通过调控下游靶基因的表达，在细胞分化、昼夜节律和应激反应等多种机体生理功能中发挥重要作用[4-5]。研究显示，DEC1在肺癌、食管癌、胃癌和肝癌等诸多实体瘤中异常表达，调节肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞的恶性增殖[6-8]。此外，多项研究证实DEC1与缺氧诱导因子低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)关系密切[6,9]，可能是肿瘤缺氧的直接标志，然而在缺氧状态下，DEC1在乳腺癌细胞中的表达变化及其对肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响尚不清楚，为此，本研究通过建立体外缺氧细胞模型，观察缺氧状态下DEC1的表达变化，进一步沉默DEC1表达分析其对乳腺癌MDA-MB-231细胞的活力、侵袭及迁移能力的影响并探讨其可能的机制，为寻找乳腺癌有效的诊疗及预后靶点提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

抗DEC1抗体购自Abcam；抗Smad3和p-Smad3抗体均购自CST；蛋白提取试剂盒、CCK-8试剂、抗GAPDH抗体与ECL发光试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂购自Invitrogen；Transwell小室购自Millipore；Matrigel人工基底膜购自BD；DMEM高糖培养液购自HyClone；DEC1-siRNA序列(5’-GAAGCAUGUGAAAGCACUATT-3’)由上海吉玛公司合成。人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株购自上海中科院细胞库。

2 主要方法

2.1细胞培养与转染 人乳腺癌MDA-MB-231细胞经复苏后培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养液中，放入37 ℃、5% CO2孵箱中常规培养，2～3 d传代。缺氧培养条件：在三通气低氧培养箱中培养，调节O2浓度为1%、CO2浓度为5%、N2浓度为94%。 将MDA-MB-231细胞以每孔1×105个接种于 6 孔培养板中连续培养，当细胞达70%～80% 融合时，按照Lipofectamine RNAiMAX产品说明书，分别将DEC1-siRNA和阴性对照siRNA (negative control siRNA, NC-siRNA)转染至6孔培养板中分别记作DEC1-siRNA组和NC组，6 h 后更换新鲜培养液，培养48 h后提取总 RNA，72 h后提取总蛋白。

2.2RT-qPCR 待细胞转染48 h后，收集各组细胞提取总RNA，逆转录获得cDNA，用于扩增DEC1目的片段的上游引物序列为5’-ACTTACCTTGAAGCATGTGAAAGCA-3’,下游引物序列为5’-CATGTCTGGAAACCTGAGCAGAA-3’；以GAPDH为内参照，GAPDH上游引物序列为5’-ATGTCGTGGAGTCTACTGGC-3’,下游引物序列为5’-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3’；反应条件为94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s (30个循环) ;同一实验重复3次，实验数据分析采用2-ΔΔCt法计算。

2.3Western blot实验 待细胞转染72 h后，收集各组细胞提取总蛋白，BCA法测定浓度后加入适量上样缓冲液(1∶4)于100 ℃煮沸5 min变性; 每孔上样 40 μg蛋白，采用80 V恒压SDS-PAGE(10%分离胶)分离后将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入Ⅰ抗(DEC1 1∶1 000、Smad3 1∶1 000、p-Smad3 1∶500)4 ℃ 孵育过夜，次日 TBST 漂洗3次，每次10 min,加入 HRP 标记的Ⅱ抗(1∶3 000)室温孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次10 min,ECL化学发光显影，采用 Quantity One 软件分析、统计数据。

2.4划痕实验 待MDA-MB-231细胞转染24 h后，去除培养液，使用无菌的200 μL枪头划痕，PBS清洗去除细胞残骸，加入无血清培养液，培养24 h后于镜下观察划痕愈合程度，拍照并计算细胞迁移率。

2.5Transwell 侵袭实验 待MDA-MB-231细胞转染24 h后，消化、收集接种入提前一天铺好60 μL Matrigel胶(Matrigel 与无血清 DMEM 培养液按体积稀释比1∶9稀释)的Transwell小室上室中，下室加入含15%胎牛血清的DMEM培养液，连续培养24 h，擦去上室细胞，甲醇固定30 min，结晶紫染色10 min，光镜下随机取3个视野，拍照并计数。

2.6CCK-8实验 待MDA-MB-231细胞转染24 h后，消化收集，按每孔3×103个接种入96孔板中连续培养3 d，待细胞贴壁时记为0 h，分别于24 h、48 h及72 h加入10 μL CCK-8试剂，在培养箱中静置4 h后，采用酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值，统计数据并分析。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P<0. 05为差异有统计学意义。

结 果

1 在常氧与缺氧状态下乳腺癌细胞MDA-MB-231中DEC1的表达检测

RT-qPCR和Western blot 结果显示，缺氧条件下人乳腺癌细胞MDA-MB-231中DEC1 mRNA及蛋白表达水平显著高于常氧条件培养的MDA-MB-231细胞(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression of DEC1 in breast cancer MDA-MB-231 cells under hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnormoxia group.

图1 在缺氧条件下乳腺癌MDA-MB-231细胞中DEC1表达变化

2 在缺氧状态下，MDA-MB-231细胞中DEC1干扰效果的检测

RT-qPCR和Western blot 结果显示，siRNA-DEC1组中DEC1基因的相对表达量显著低于NC组和空白对照组(P<0.01)，见图2。

Figure 2.The mRNA (A) and protein (B) expression level of DEC1 in transfected MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

图2 转染siRNA-DEC1后细胞中 DEC1表达水平的变化

3 在缺氧状态下，沉默DEC1表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示，在缺氧条件下，与空白对照组和NC组相比，siRNA-DEC1组中MDA-MB-231细胞活力下降(P<0.05)，见图3。

4 在缺氧状态下，沉默DEC1表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，在缺氧条件下，与空白对照组和NC组相比，siRNA-DEC1组中细胞穿过基底膜的数量显著减少(P<0.01)，见图4。

5 在缺氧状态下，沉默DEC1表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，在缺氧条件下，与空白对照组和NC组相比，siRNA-DEC1组中MDA-MB-231细胞迁移能力显著减弱(P<0.01)，见图5。

Figure 3.The effect ofDEC1silencing on the viability of MDA-MB-231 cells was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

图3 CCK-8实验检测沉默DEC1表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231活力的影响

Figure 4.The effect ofDEC1silencing on the invasion ability of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

图4 Transwell 实验检测沉默DEC1表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响

Figure 5.The effect ofDEC1silencing on the migration ability of MDA-MB-231 cells was detected by Wound healing assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

图5 划痕实验检测沉默DEC1表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响

6 缺氧状态下，沉默DEC1表达对TGF-β/Smad3信号通路关键分子表达的影响

Western blot 结果显示，siRNA-DEC1组中p-Smad3蛋白表达水平显著低于NC组和空白对照组(P<0.05)，而Smad3蛋白表达无显著差异，见图6。

Figure 6.The effect ofDEC1silencing on the protein levels of Smad3 and p-Smad3 in the MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

图6 沉默DEC1表达对MDA-MB-231细胞中Smad3和p-Smad3蛋白水平的影响

讨 论

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一，在我国城乡乳腺癌的发病率逐年上升且呈年轻化趋势[10]。近年来，虽然靶向治疗转化性研究的开展，在针对乳腺癌复发转移病灶的靶点治疗上取得了很大进展，但由于乳腺癌存在广泛的遗传异质性，患者的5年生存率仍不容乐观[11]。因此，探索与乳腺癌发生、发展密切相关的基因，对揭示乳腺癌的发病机制，提高乳腺癌的诊疗水平具有重要意义。

在本研究中，通过体外构建肿瘤缺氧模型以分析缺氧对DEC1表达的影响，结果显示在缺氧条件下，乳腺癌MDA-MB-231细胞中DEC1 mRNA和蛋白表达水平均显著增高，表明缺氧环境可引起MDA-MB-231细胞内DEC1表达的变化。为了明确在缺氧条件下DEC1表达增高对MDA-MB-231细胞的生物学功能的影响，研究进一步采用RNA干扰技术，观察沉默DEC1基因后，MDA-MB-231细胞活力、侵袭及迁移能力的变化。结果显示，在缺氧条件下沉默DEC1表达，可导致MDA-MB-231细胞活力、侵袭及迁移能力显著下降，由此提示DEC1作为一种低氧调控基因，在缺氧条件下DEC1高表达对乳腺癌细胞耐受缺氧环境具有重要作用。此外，越来越多的证据表明，缺氧是决定乳腺癌预后的重要因素[12]，因此，DEC1可能作为乳腺癌新的诊疗靶点，对改善乳腺癌患者预后具有重要意义。

肿瘤的发生发展涉及诸多信号通路的异常活化，其中TGF-β/Smad3信号的异常活化在肿瘤的发生、浸润过程中起着重要的调控作用，活化的II型TGF-β受体引起Smad3磷酸化，转位进入细胞核继而调节下游靶基因转录[13-14]。研究报道，活化的TGF-β/activin信号可通过快速诱导DEC1基因转录重置哺乳动物的生物钟，而这一过程需要依赖于Smad3分子的磷酸化[15]。在鳞癌细胞中，Smad3可通过正调控DEC1表达参与调节细胞的增殖与迁移能力的变化[16]。此外，在TGF-β存在的情况下，靶向沉默DEC1可下调胰腺癌细胞中p-Smad3、转录因子Snail以及N-cadherin的表达，继而在上皮间质转化进程中发挥重要作用[17]。而在本研究中，在缺氧条件下沉默DEC1表达后，Smad3表达无显著变化，p-Smad3表达显著下降，提示TGF-β/Smad3信号通路被阻断，DEC1可能依赖TGF-β/Smad3 信号通路发挥其促肿瘤侵袭作用，同时我们猜测在缺氧条件下，DEC1可能对Smad3的磷酸化水平存在负反馈调节作用，然而其具体机制仍有待我们进一步研究，而本实验结果为明确p-Smad3与DEC1之间的相互关系提供了新的证据。

综上所述，在缺氧条件下，DEC1可能通过调控TGF-β/Smad3信号通路参与乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭转移进程，而其与缺氧彼此之间的关系将为乳腺癌靶向治疗提供一个潜在的研究方向。