乙酰左旋肉碱减轻H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤*

沈 娟， 高 枫， 郝 琴， 赵 琳,2， 杨彦玲△

(1延安大学医学院， 2延安市神经科学重点实验室， 陕西 延安 716000)

氧化应激是指在体内外有害因素刺激下，体内自由基产生增加或机体清除氧自由基能力下降，造成核酸、蛋白质和脂质等生物分子的损伤[1]。近年来，氧化应激已经成为导致脑血管疾病、创伤性疾病、阿尔茨海默症和帕金森氏症等神经系统退行性疾病发生和发展中的重要病理因素[2-4]。PC12 细胞株来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，但因其可分化为具有交感神经元特性的细胞，常用于神经系统疾病的相关研究[5-6]；乙酰左旋肉碱(acetyl-L-carnitine，ALC)为左旋肉碱的酯化物，是一种强抗氧化剂，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎症等广泛的药理作用而备受学者们关注[7-8]，且极易通过血脑屏障到达中枢神经[9]，具有明显的神经保护作用[10]，且ALC在提高男性生育能力方面的应用已得到公认。

本研究通过H2O2建立PC12细胞氧化损伤模型，采用ALC预处理PC12细胞，观察其对氧化损伤模型细胞活力及凋亡的影响，探讨ALC对PC12细胞氧化损伤的作用。同时，通过检测cleaved caspase-3和核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)的蛋白水平以及对Nrf2核转位的影响，探讨该药物对PC12细胞氧化损伤的可能机制，为临床应用ALC治疗神经系统退行性疾病提供理论和实验依据。

材 料 和 方 法

1 实验材料

大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞株购自中科院上海细胞库。乙酰左旋肉碱和0.25% 胰酶购自Sigma；30%的H2O2购自天津化学试剂有限公司；RPMI-1640培养基和胎牛血清购自Gibco；CCK8购自索莱宝公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒和细胞核蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒购自上海生工；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自Thermo；抗Nrf2、cleaved caspase-3、GAPDH和Lamin B1抗体购自CST。酶标仪购自TECAN；凝胶成像系统购自Bio-Rad。

2 方法

2.1细胞的培养 PC12细胞培养于含10% FBS和1%青链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长铺满整个瓶底时，加入0.25% 胰酶消化、传代，继续培养，传代严格控制在3～4代以内，取生长状态良好的对数期细胞用于后续实验。

2.2CCK8法检测不同浓度H2O2作用下的细胞活力 收集对数期的PC12细胞，将1×109/L的细胞悬液种于96孔板上，待细胞生长至对数期，加入不同浓度(50、100、200、300、400和500 μmol/L)的H2O2分别作用细胞2 h、4 h和6 h，每组设置3个孔，以未加H2O2的孔作为对照，置于37 ℃、5% CO2培养箱中作用不同时间(2 h、4 h和6 h)；用1×PBS清洗2遍，加入100 μL RPMI-1640完全培养基和10 μL CCK8检测液，37 ℃孵育4 h，酶标仪检测每孔在波长450 nm处的吸光度，最后进行分析计算。以半数抑制浓度[11](细胞活力下降50%左右)作为模型制备的最佳损伤条件[12]，造成细胞中度氧化损伤模型[13]。

2.3ALC对细胞活力的影响 收集对数生长期的PC12细胞，将1×109/L的细胞悬液种于96孔板上，待细胞生长至对数期，加入不同浓度(50、100、200、300、400和500 μmol/L)的ALC培养24 h，用CCK8法检测细胞活力，方法同2.2。筛选出ALC药物的安全浓度。根据上述结果，选择3个不同浓度作为ALC低、中、高浓度组进行后续实验。

2.4ALC对H2O2刺激的细胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平的影响 取对数生长期的 PC12细胞，药物组加入ALC预处理24 h后，吸弃原液，药物组和模型组中均加入H2O2作用2 h，用无血清培养基冲洗细胞1次，加入荧光探针 DCFH-DA 10 μmol/L，37 ℃孵育1 h。流式细胞仪上机检测细胞荧光，重复3次。

2.5ALC对H2O2刺激的细胞凋亡的影响 根据CCK8结果选取ALC浓度为100、200和400 μmol/L分别作为低、中、高浓度组。取对数生长期的 PC12细胞，药物组加入不同浓度ALC预处理24 h后，和模型组中均加入H2O2，作用同样时间，正常对照组不加H2O2，弃掉培养液，加入10 μL annexin V-FITC和5 μL PI，4 ℃染色30 min，流式细胞术分析细胞的凋亡率。

2.6ALC对细胞凋亡蛋白以及Nrf2信号通路蛋白水平的影响 按照前面的培养条件，药物预处理后再加入H2O2作用一定时间，收集各组细胞，洗涤、离心后，加入含PMSF的细胞裂解液，冰上裂解30 min，离心吸取上清液为提取的总蛋白，细胞核蛋白/胞浆蛋白提取按照试剂盒说明书进行，BCA法检测蛋白浓度后稀释至一定浓度，-20 ℃保存。洗净、晾干玻璃板，灌入15%的分离胶至预定高度，并加入双蒸水液封，室温下静置1 h 。配制5%浓缩胶，弃去双蒸水，加入浓缩胶，插入梳子，室温静置30 min。将配置好的凝胶板置于电泳槽中，加入电泳液；将蛋白样品与6×样品缓冲液混合，100 ℃煮沸5 min，每孔加入15 μL 样品，进行电泳；浓缩胶电压调至80 V，分离胶电压为120 V，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。采用转膜电流300 mA，电流转膜60～90 min，将凝胶中的蛋白转移至PDVF膜。加入5% 脱脂奶粉封闭2 h ；加入 I 抗稀释液，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min；加入 II 抗稀释液，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；曝光、显影、显色，凝胶成像系统测定其灰度值，分析目的蛋白与内参照GAPDH的灰度值比值，实验重复3次，取平均值。

2.7免疫荧光染色观察ALC对Nrf2核转位的影响 细胞培养于含10% FBS和1%青链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，待细胞长到汇合度为80%时，胰酶进行消化，血清终止消化后，培养基调整细胞密度为每孔1×104个细胞，接种于24孔板中(含细胞培养爬片)，每孔加入1 mL培养基。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。ALC预处理24 h后，再加入H2O2氧化应激造模2 h，弃掉培养上清；小心取出细胞爬片置于载玻片上，1×PBS轻柔清洗2次，用4%多聚甲醛500 μL(以盖住爬片为宜)，室温下固定45 min；PBS洗3次，每次5 min；加入0.3%Triton X-100的10% normal goat serum-PBS溶液500 μL室温下封闭1 h；封闭液按1 ∶200稀释Nrf2抗体；滴加到细胞爬片上，阴性对照组用PBS代替 I 抗，湿盒内4 ℃过夜，室温复温45 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加对应 II 抗，室温避光孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加少量DAPI染色液，室温放置5 min，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min；滴加抗荧光猝灭封片，注意避免产生气泡。荧光显微镜下观察，随机取3个视野，分析蛋白表达情况及核转移水平。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计处理。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组内多个样本均数之间两两比较用Tukey法(Tukey multiple comparison test)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度H2O2对PC12细胞活力的影响

CCK8实验结果显示，与对照组相比，50～500 μmol/L的H2O2作用不同时间(2 h、4 h和6 h)均显著降低PC12细胞活力(P<0.01)，见图1。以半数抑制浓度为选取标准，200 μmo/L的H2O2刺激2 h和50 μmol/L的 H2O2刺激4 h符合条件。后续实验中我们选取200 μmol/L的H2O2作用2 h为建立氧化损伤模型的条件。

Figure 1.The effect of H2O2at different concentrations on the viability of PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vseach H2O2group with different time.

图1 不同浓度H2O2对PC12细胞活力的影响

2 ALC对H2O2刺激的PC12细胞活力的影响

同样，CCK8法检测细胞活力的结果显示，ALC的处理浓度在100～500 μmol/L时不会显著降低细胞活力，而50 μmol/L浓度预处理24 h时，则显著引起细胞活力降低(P<0.05)，见图2A。这说明ALC的安全浓度为100～500 μmol/L，因此我们取100、200和400 μmol/L浓度作为低、中、高浓度组进行后续实验。同样，CCK8检测结果显示，ALC(100、200和400 μmol/L)药物预处理均能明显提高H2O2介导的PC12细胞活力(P<0.01)，见图2B。

3 ALC对H2O2刺激的PC12细胞形态的影响

在倒置显微镜下，对照组细胞大小均一，细胞形态呈多边形，细胞饱满，轮廓清晰，边缘有小突起，折光性强，细胞贴壁紧密。模型组中正常细胞数量明显减少，细胞大小不一，并且呈梭形、类圆形，细胞肿胀，细胞边缘毛糙，细胞皱缩，贴壁松弛，折光率较差,部分细胞因坏死或凋亡而脱壁。但在ALC预处理组中，低浓度组较模型组，细胞形态明显改善，部分细胞出现多边形，折光率增加；在中、高浓度ALC组，正常细胞数量增多，尤其在中浓度200 μmol/L组中，正常细胞数量明显增加，细胞形态和折光率与对照组无明显差异，细胞饱满，大多数细胞仍保持多边小突起形态，见图3A。对各组受损细胞进行计算分析，与H2O2组相比，ALC药物预处理后，受损细胞数目明显减少(P<0.01)，说明ALC能够减少H2O2诱导的 PC12 细胞损害，见图3B。

Figure 2.The effect of ALC on the viability of PC12 cells. A: PC12 cells were treated with different concentrations of ALC for 12 h and 24 h; B: PC12 cells were pre-incubated with different concentrations of ALC for 24 h and then cotreated with H2O2. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

图2 ALC对H2O2介导的PC12细胞活力的影响

Figure 3.Microscopic observation of cell morphology (×200) and the count of damaged cells in different groups. Mean±SD.n=5.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

图3 显微镜观察细胞形态和各组受损细胞数量的比较

4 ALC对细胞内活性氧生成的影响

流式细胞术分析结果显示，经过不同浓度的ALC预处理后，细胞内ROS的水平逐渐降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明ALC能够清除H2O2诱导的 PC12 细胞内异常增多的ROS，见图4。

Figure 4.The effect of ALC on H2O2-mediated ROS levels in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

图4 ALC对H2O2介导的PC12细胞ROS水平的影响

5 ALC对细胞凋亡的影响

流式细胞术分析结果显示，与模型组相比，不同浓度的ALC均可减轻H2O2诱导的PC12细胞凋亡(P<0.01)，见图5。

Figure 5.The effect of ALC on the apoptosis of PC12 cells stimulated with H2O2. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

图5 ALC对H2O2介导的PC12细胞凋亡的影响

6 ALC对抗氧化蛋白与凋亡相关蛋白水平的影响

Western blot条带灰度分析结果显示，ALC均可显著调节Nrf2和cleaved caspase-3的表达量。与模型组比较，ALC(100、200和400 μmol/L)预处理组胞浆内Nrf2表达呈下降趋势(P<0.01)，核内Nrf2表达呈上升趋势(P<0.01)；与模型组比较，ALC(100、200和400 μmol/L)预处理组总cleaved caspase-3的蛋白水平下降(P<0.01)，见图6。

Figure 6.Western blot analysis was used to determine the effect of ALC on the protein levels of Nrf2 and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsH2O2group.

图6 Western blot法检测ALC对Nrf2和cleaved caspase-3蛋白水平的影响

7 ALC对Nrf2核转位的影响

免疫荧光染色观察结果显示，正常组Nrf2主要在胞浆内表达，模型组与ALC药物处理组胞浆和胞核内均有表达，且ALC组胞核内表达阳性细胞数增多，见图7A。核内Nrf2表达阳性细胞计数分析结果显示，与模型组比较，ALC组核内Nrf2阳性细胞明显增多，其中200 μmo/L组的差异最为显著(P<0.01)，见图7B。

讨 论

近年来认识到氧化应激涉及循环、疾病、呼吸、消化、泌尿及生殖等多个系统多种疾病的发生发展[14]。因此，减缓或抑制氧化应激反应已成为疾病发生机理研究中需要解决的重要问题。本实验研究结果显示，ALC对H2O2诱导的PC12细胞具有显著抑制凋亡，提高细胞活力的作用。Western blot实验结果提示，ALC可明显下调激活型caspase-3(cleaved caspase-3)蛋白的水平，而上调Nrf2蛋白的水平。因此，ALC对氧化损伤的细胞模型具有一定的保护作用。

Nrf2是近年来新发现的一种核转录因子。在生理状态下，Nrf2主要存在于细胞质中，与肌动蛋白结合蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)结合，处于相对抑制状态。生理条件下Keap1经泛素连接酶Gul 3，以泛素化底物结合蛋白的形式与Nrf2在胞浆结合，因此，Keap1主导Nrf2泛素化降解，维持Nrf2于正常水平，从而抑制下游基因的表达。Nrf2- Keap1/ARE通路是近年来研究最多的内源性抗氧化应激通路[15]，在抗氧化损害方面扮演着重要的角色[16]。Keap1是Nrf2-Keap1/ARE信号通路的主调节器，可根据细胞内的氧化还原状态打开或关闭Nrf2-Keap1/ARE[17]。在氧化应激、炎性损伤等病理状态下，Keap1的构象通过丝裂原活化蛋白激酶、磷脂肌醇激酶和磷脂肌醇信号等途径发生变化，Nrf2与Keap1发生解离并转移进细胞核内，与Maf结合形成异二聚体，识别ARE上的结合位点并与之结合，启动下游靶基因抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因等的转录，提高细胞抵抗外源性损伤的能力。研究表明，随着年龄增长脑中Nrf2表达下降, 导致氧化应激反应失衡[18]。因此，Nrf2信号通路可能是治疗神经退行性疾病潜在的研究方向。在AD患者脑中Nrf2 主要定位在海马神经元的细胞质中，细胞核 Nrf2 表达水平较正常对照组明显下降[19]。在本实验中，免疫荧光染色结果显示，ALC预处理组核内Nrf2表达阳性的细胞数明显多于模型组，也进一步验证了Western blot的结果。以上结果说明，ALC能促进胞浆内Nrf2向胞核内转移。大量的实验研究发现，Nrf2能对抗细胞的氧化应激反应[20-22]。也有学者在体研究发现，激活Nrf2通路对脊髓损伤具有神经保护作用[23-24]。除此，更多研究提示Nrf2与炎症[25-26]、凋亡[27-28]和自噬[29-30]也存在复杂关系。因此，如何有效地激活Nrf2-keap1/ARE通路已经越来越受到研究者的重视。本研究结果揭示，乙酰左旋肉碱通过激活Nrf2通路抑制氧化应激引起的细胞凋亡，提高细胞存活率。

Figure 7.Immunofluorescence staining was used to observe the effect of ALC on Nrf2 nuclear translocation. A: the expression position of Nrf2 (the scale bar=50 μm); B: the quantitative analysis of nucleus Nrf2 positive cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsH2O2group.

图7 免疫荧光染色观察ALC对Nrf2核转位的影响