果糖通过激活Akt信号通路促进3T3-L1细胞的脂肪分化*

李颖霞， 姜利彬， 徐海燕， 樊周沛， 何益信， 温洪涛

(郑州大学第一附属医院消化内科， 河南 郑州 450000)

果糖(fructose)是与葡萄糖同分异构的单糖；近几十年来，基于果糖具有血糖生成指数较低及高甜度等优点，居民以蔗糖和高果糖玉米糖浆这2种方式摄取的果糖的量正在逐年增加[1-2]。在人体中，果糖主要在肝脏中代谢为果糖-1-磷酸，随后以磷酸二羟丙酮和磷酸甘油醛的形式进入糖酵解、脂质合成和糖异生等循环过程[3]。越来越多的实验研究证明，摄入过多的果糖能显著增加体重，促进内脏肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗等代谢综合征的发生风险[4-6]。然而，高果糖摄入是如何引起病理改变的分子机制尚不清楚。

肥胖是许多疾病，如糖尿病的明确危险因素。当前体脂肪细胞增殖和分化异常增多时，会引起体内脂肪组织过多的积累和内分泌紊乱，继而引发糖尿病和高血压等疾病[7-9]。由此可见，研究前体脂肪细胞的增殖和分化过程有助于我们了解疾病的分子机制，同时，在临床上适度抑制前体脂肪细胞分化可以达到预防及改善疾病的效果，对于研究预防和治疗肥胖及代谢性疾病具有重大的意义。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)[10-11]和CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)是目前已知的调节前体脂肪细胞分化的转录因子[12]，它们能够促进下游脂质积累及脂质代谢相关的酶，如脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4;又称脂肪细胞蛋白2，adipocyte protein 2, aP2)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthesis，FAS)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)等的表达[13]，对于调控前体脂肪细胞的分化是十分重要的。Zubiría等[14]在正常成年雄性大鼠的饮水中加入含有10% (W/V)果糖的食物(fructose-rich diet，FRD)，并评估内脏脂肪组织(visceral adipose tissue，VAT)垫体积变化及分离的基质-血管段(stromal-vascular fraction，SVF)前体脂肪分化及增殖情况，在流式细胞学方法证实VAT前体细胞群数量在各组之间没有差异的情况下，连续喂养3周后发现，给予果糖喂养的大鼠血浆中胰岛素、甘油三酯和瘦素的水平显著增加，同时来源于腹膜后脂肪组织(retroperitoneal adipose tissue，RPAT)脂肪前体细胞(adipocyte precursor cells，APCs)中Zpf423和PPARγ2的表达水平显著增加；饲养8周后，RPAT质量增加和APCs体积增大[15]，表明果糖对前体脂肪细胞的增殖和分化具有直接影响。

研究表明胰岛素诱导的Akt信号通路是脂肪分化过程中的核心信号通路[16-17]。鉴于果糖和肥胖之间的潜在联系，且果糖在体外如何调控前体脂肪细胞分化尚不清楚，我们对3T3-L1细胞模型进行果糖诱导，通过油红O染色、RT-qPCR和Western blot实验检测前体脂肪细胞分化期间相关基因及蛋白的表达变化，进一步阐明果糖对3T3-L1前脂肪细胞分化过程的影响及具体作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞株 3T3-L1细胞系购自ATCC细胞库(ATCC®CL-173TM)。

1.2试剂 果糖(Sigma-Aldrich，CAS：108311-21-3)；胰蛋白酶、DMEM高糖培养基(葡萄糖4.5 g/L)及优质胎牛血清(Gibco)；蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和II 抗(上海碧云天)；抗PPARγ(# 2435)、aP2(# K1708)、p-Akt(# 4060P)和Akt(# 9272)抗体(Cell Signaling Technology)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、油红O、抗β-肌动蛋白抗体、地塞米松、Akt特异性阻断剂LY294002(# L9908)及胰岛素(Sigma)；实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)；TRIzol试剂(Life Technology)。

2 方法

2.13T3-L1细胞的培养并诱导分化 在37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养3T3-L1细胞，并将细胞分成空白对照(control)组、诱导分化(differentiation medium，DM)组以及诱导分化+果糖处理组(DM+fructose组)，处理组果糖的终浓度是1 g/L。细胞以1×109/L密度接种于6孔板上，待细胞100%融合并接触抑制2 d，利用经典鸡尾酒方法[18]进行诱导分化：含有0.5 mmol/L IBMX、1.0 μmol/L地塞米松、1 mg/L胰岛素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养细胞2 d，随后换成含1 mg/L胰岛素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养，每2 d换培养液1次，直到分化成熟。

2.2油红O染色及定量 PBS洗涤细胞3次后，在室温条件下用4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗涤3次并干燥。加入油红O工作液室温孵育30 min，双蒸水冲洗2次后用显微镜观察。为了量化细胞内脂质含量，用等量的100%异丙醇进行油红O萃取，最后在波长510 nm处测量吸光度(A)值。

2.3RT-qPCR 根据TRIzol试剂提取诱导分化的细胞总RNA。具体操作方法基于TaKaRa逆转录试剂盒的操作说明。使用小鼠GAPDH作为内参照，并使用cDNA的第1链为作为模板，通过real-time PCR检测基因表达。引物序列见表1。大致反应程序为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s、64 ℃退火延伸30 s，共40个循环。

2.4Western blot 实验 当接种后的3T3-L1细胞培

表1 RT-qPCR实验的引物序列

Plin2: perilipin-2.

养至80%覆盖时，通过上诉方法诱导分化。加入裂解缓冲液，4 ℃静置30 min, 超声破碎30 s，12 000×g离心20 min，取上清。通过SDS-PAGE分离总蛋白并转移至PVDF膜。用5%的脱脂牛奶(用含0.1% Tween-20的PBST稀释)封闭1.5 h，加入抗PPARγ、aP2、p-Akt和Akt抗体，在4 ℃过夜后，PBST冲洗3次，加入第 II 抗体，在室温下孵育1 h，再用PBST漂洗3次。用显影剂将PVDF膜着色并曝光到X射线胶片上，用ImageJ 1.48软件进行灰度分析。

3 统计学处理

使用SPSS 23.0统计软件进行数据的统计学处理。实验数据以均数±标准差(mean±SD)的形式呈现，多组间比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 果糖促进3T3-L1前脂肪细胞分化

为探究果糖对3T3-L1细胞脂肪分化过程的调控作用，在诱导分化的3T3-L1细胞中加入1 g/L果糖进行干预，收获自诱导分化开始后3 d的细胞。Western blot分析3T3-L1细胞中分化标志蛋白PPARγ和aP2的表达水平，结果显示，与DM组比较，DM+fructose组细胞内的PPARγ和aP2蛋白表达水平在第3天显著上调(P<0.01),见图1A。

油红O染色结果显示，DM+fructose组中脂肪细胞的体积增加，脂滴在胞质内的积累量也明显增加;定量发现DM+fructose组中脂质的积累量显著增加(P<0.01)，见图1B。同时，RT-qPCR结果显示，DM+fructose组中，细胞内Plin2的mRNA表达水平上调32%(P<0.01)，C/EBPα的mRNA表达水平上调15%(P<0.01)，C/EBPβ的mRNA表达水平上调23%(P<0.05)，见图1C。以上实验结果提示果糖对3T3-L1细胞的脂肪分化具有促进作用。

2 果糖激活3T3-L1前脂肪细胞的Akt信号通路

许多研究已经证实，Akt信号通路在脂肪分化中起着重要作用[19]。我们预先利用果糖处理细胞30 min，Western blot检测p-Akt和Akt的蛋白水平变化，观察果糖对细胞Akt信号通路的影响。结果显示,实验(DM+fructose)组的细胞中p-Akt水平比对照组显著增加(P<0.01)，而使用Akt的特异性阻断剂LY294002(10 μmol/L)预先处理1 h后，Akt的磷酸化被抑制，恢复至本底水平(P<0.01),见图2。这提示果糖能快速激活3T3-L1细胞的Akt信号通路。

3 果糖通过Akt信号通路促进3T3-L1脂肪分化

分析以上结果我们发现，果糖可激活脂肪细胞中的Akt信号通路，但具体调控细节尚不可知。因此，我们加入Akt的特异性阻断剂 LY294002，来观察果糖是如何影响 3T3-L1前脂肪细胞的分化。利用 LY294002(10 μmol/L)预先处理细胞 1 h，再将DM组和DM+Fructose组中的3T3-L1细胞进行诱导分化。结果显示，使用 LY294002 阻断Akt通路后，脂肪分化的细胞标志物PPARγ和aP2的诱导表达恢复至本底水平(P<0.01)，见图3A;同时，油红O染色结果显示，诱导细胞(DM+fructose组)胞质内出现脂质积累和形成脂肪滴，而实验组(DM+fructose+LY294002组)几乎没有脂肪细胞形成，见图3B，证实Akt 信号通路在脂肪分化中起主导作用。该结果提示，果糖对Akt信号通路的活化与其对3T3-L1脂肪分化的促进作用可能直接相关，并呈正性调控作用。

讨 论

尽管已有临床数据证实，果糖较葡萄糖更能促进肥胖并且降低肥胖患者体内的胰岛素敏感性[20]。在同等高浓度1～4.5 g/L状态下，果糖的运输量远高于葡萄糖。而在低浓度0.1 g/L时，果糖可以比葡萄糖更加有效地被吸收，与低浓度果糖依赖葡萄糖转运体5(glucose transporter type 5，GLUT5)的刺激作用有关[21]。但是果糖对于脂肪分化形成及脂质代谢的作用机制尚未明确。摄入的果糖中约50%～60%在肝脏代谢，20%在肾脏中代谢，其余部分到达外周组织，如脂肪中[22]。由于果糖的代谢不受果糖-1,6-二磷酸酶的限制，因此肝脏中只有一小部分果糖转化为糖原或者乳酸，大部分果糖都会进入脂质新生的代谢途径中[23]，进而再次循环代谢产生大量的甘油三酯和胆固醇。

Figure 1.Fructose promoted adipose differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. A: the protein expression of PPARγ and aP2 in the 3T3-L1 cells after treated with fructose at 1 g/L for 3 d; B: the differentiation process of the 3T3-L1 cells after adding 1 g/L fructose for 14 d (oil red O staining, the scale bar=100 μm; isopropanol was used to extract oil red O and the absorbance of 510 nm was detected); C: RT-qPCR was used to detect the relative mRNA expression levels of Plin2, C/EBPα and C/EBPβ in the 3T3-L1 cells after adding fructose at 1 g/L for 3 d to induce adipose differentiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group or DM group.

图1 果糖促进3T3-L1细胞的脂肪分化

Figure 2.Fructose activated Akt signaling pathway in the 3T3-L1 preadipocytes. The 3T3-L1 cells were treated with 1 g/L fructose or 1 g/L fructose+10 μmol/L LY294002 for 30 min, and the protein level of p-Akt was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group or DM group;##P<0.01vsDM+fructose group.

图2 果糖激活3T3-L1细胞中的Akt信号通路

Figure 3.Fructose promoted adipose differentiation of 3T3-L1 cells through Akt signaling pathway. A: the protein levels of PPARγ and aP2 were determined by Western blot; B: the differentiation process of the 3T3-L1 cells (oil red O staining, the scale bar=100 μm; isopropanol was used to extract oil red O and the absorbance of 510 nm was detected). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group or DM group;##P<0.01vsDM+fructose group.

图3 果糖通过激活Akt信号途径促进3T3-L1细胞的脂肪分化

脂肪前体细胞可在促脂肪生成信号刺激下向脂肪细胞分化，获得对胰岛素的敏感性，促进细胞内脂质的积累。本研究中，我们研究了果糖对3T3-L1细胞脂肪分化的影响及Akt信号通路在3T3-L1前体脂肪细胞分化中发挥重要作用。我们发现果糖促进3T3-L1前体脂肪细胞分化，这种作用可能是通正性调节Akt信号通路来实现，提示果糖可能是治疗疾病的新靶点，对于肥胖发病机制的探究也具有一定的理论意义。但本实验基于体外环境的细胞实验，较高的果糖浓度在正常生理条件下是不存在的。因此，未来需要借助更加完善和深入的临床实验来佐证当前研究结果。

3T3-L1细胞可高效利用果糖。在本研究中，我们对诱导分化的脂肪细胞进行油红O染色及定量研究，发现DM+fructose组中细胞内脂滴明显多于空白对照组和DM组。CEBPs和PPARγ是调控如ACC、FAS、aP2和GLUT4等靶基因的重要转录因子[24]。为了进一步探讨果糖促进脂肪细胞分化的可能机制，本实验对分化的早期标志物C/EBPα、C/EBPβ和Plin2的mRNA进行RT-qPCR验证及PPARγ和aP2的蛋白表达量改变进行检测。实验证明给予1 g/L的果糖干预可以显著上调脂肪细胞C/EBPα、C/EBPβ和Plin2的mRNA与PPARγ和aP2蛋白的表达。

Akt信号途径在胰岛素的靶组织中发挥传导信号、促进组织对糖的摄取，维持正常的糖代谢和脂肪组织形成中起重要作用[25]。在本研究中，我们发现Akt是参与调控脂肪定向分化的信号通路，果糖能快速激活3T3-L1细胞的Akt信号通路。在以往研究中，Yang等[26]发现当PI3K-Akt信号通路被抑制之后，间充质干细胞会出现胰岛素耐受和脂肪分化会受到影响。胰岛素和其信号通路下游分子IRS-1、PI3K-Akt以及CREB都是脂肪分化的关键调控因子[27-28]，进一步佐证了本实验的研究结果。

总之，本研究在体外环境中证实果糖正性调控3T3-L1脂肪细胞的分化，并可能是通过激活Akt信号通路发挥促进作用。这为阐明特定病理生理条件下果糖的生物学效应和作用机制奠定了基础，也为由肥胖及相关并发症的临床治疗提供一定的理论依据。此外，本研究所使用的诱导分化培养基目的是激活和诱导3T3-L1的脂肪分化，研究中使用的果糖同样也具有该功能，因此果糖和DM之间是否会存在一定的联合作用或者协同作用，将会在今后的研究中深入探究。