洋葱总黄酮减轻过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤*

姚贤凤， 郑开金， 陈 梅， 王利民

(贵阳中医学院第一附属医院眼科，贵州 贵阳 550002)

年龄相关性黄斑病变等眼底疾病是常见的危害人类生命健康的疾病；这些眼底疾病的发生与视网膜色素上皮细胞功能障碍和损伤有关；视网膜色素上皮细胞对于视色素合成、收散色光线等均具有重要意义；氧化应激是常见的视网膜色素上皮细胞损伤的诱导因素之一，是由细胞内过量的氧自由基引起的[1-2]。洋葱总黄酮(total flavonoids of onion，FO)是从洋葱中提取出来的活性成分，具有多种生物学作用，目前已知其具有抗肿瘤、改善糖尿病视网膜病变和神经保护等作用[3-5]。有研究表明，洋葱总黄酮处理后糖尿病视网膜组织中细胞凋亡减少，组织中氧化应激水平降低，洋葱总黄酮具有抗氧化应激的作用[6]。本实验用过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)处理视网膜色素上皮细胞构建细胞氧化应激模型，探讨洋葱总黄酮对视网膜色素上皮细胞氧化应激的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

视网膜色素上皮ARPE-19细胞以含有10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液培养，细胞培养条件为37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱。H2O2购自Sigma；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平检测试剂盒购自Molecular Devices；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒和丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；胞质蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术研究所；抗细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗体购自Abcam；抗活化型caspase-3(cleaved caspase-3)和活化型caspase-9(cleaved caspase-9)抗体购自Abbkine；洋葱总黄酮由贵州省医学分子生物学重点实验室实验室提取保存。

2 方法

2.1实验分组处理 将ARPE-19细胞分为对照(control)组、H2O2组、低浓度FO处理+H2O2(low concentration of FO+H2O2,FO-L+H2O2)组、中浓度FO处理+H2O2(medium concentration of FO+H2O2,FO-L+H2O2)组和高浓度FO+H2O2(high concentration of FO+H2O2，FO-H+H2O2)组。处理方法如下：control组用含有0 mg/L洋葱总黄酮和0 μmol/L H2O2的培养液培养24 h；H2O2组用含有0 mg/L洋葱总黄酮和200 μmol/L H2O2的培养液培养24 h；FO-L+H2O2组用含有30 mg/L洋葱总黄酮和200 μmol/L H2O2的培养液培养24 h；FO-M+H2O2组用含有60 mg/L洋葱总黄酮和200 μmol/L H2O2的培养液培养24 h；FO-H+H2O2组用含有90 mg/L洋葱总黄酮和200 μmol/L H2O2的培养液培养24 h。

2.2MTT法检测细胞活力 调整ARPE-19细胞密度为2.5×107/L，种植到96孔板中，每个孔中添加100 μL的细胞悬浮液，培养过夜后，按照control、H2O2、FO-L+H2O2、FO-M+H2O2和FO-H+H2O2分组处理。24 h后，终止培养，在每个孔中添加20 μL的MTT溶液，继续孵育培养4 h。将孔内的液体吸弃，添加150 μL的DMSO溶液，置于摇床上孵育5 min。在590 nm的分光光度仪上检测吸光度(A)值，经过空白孔调零以后，设置control组细胞存活率为100%，分析其余各组细胞存活率。

2.3流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞分组处理培养24 h后，用PBS将细胞悬浮以后，在细胞中添加结合缓冲液100 μL，孵育15 min以后，继续添加10 μL的PI和5 μL的annexin V-FITC。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4DCFH-DA荧光探针检测细胞中ROS水平 ARPE-19细胞接种到24孔板中，按照control、H2O2、FO-L+H2O2、FO-M+H2O2和FO-H+H2O2分组处理。培养24 h后，在细胞中添加DCFH-DA染液，用荧光显微镜观察荧光强度，以荧光强度表示ROS水平。

2.5细胞中SOD活性和MDA含量的检测 各组细胞分组处理培养24 h后，收集细胞，用试剂盒检测细胞中SOD活性和MDA含量，SOD检测用WST法，MDA含量检测用TBA法，步骤均遵循试剂盒说明书。

2.6JC-1法检测细胞线粒体膜电位 各组细胞分组处理培养24 h后，在细胞中添加浓度为2 mg/L的JC-1染液孵育培养30 min以后，在细胞中添加细胞培养液洗涤细胞2次以后，以细胞培养液悬浮细胞以后，分别检测485 nm激发波长及535 nm和590 nm发射波长下红绿荧光比值，以红绿荧光比值表示线粒体膜电位。

2.7Western blot检测胞质中Cyt C蛋白水平及细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平 各组细胞分组处理培养24 h后，收集细胞，按照试剂盒提取细胞质中的总蛋白，同时提取细胞中总蛋白。按照下述方法进行Western blot检测：用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，吸取蛋白样品添加至5×上样缓冲液混合(二者体积比为4 ∶1)。在电泳槽内添加电泳液，采用10% SDS-PAGE，每个泳道中上样量为30 μg，marker上样量为5 μL，以80 V的电压电泳30 min，调整电压至120 V继续电泳，直到溴酚蓝染料进入到底部以后，停止电泳。按照常规半干法进行转膜(转膜参数：120 mA，90 min)。取出电转结束后的NC膜，放在含有5%牛血清白蛋白封闭液的平皿内孵育结合1.5 h。将NC膜取出，置于含有 I 抗的反应液中在4 ℃结合过夜，再与 II 抗(1 ∶2 000稀释)置于室温中孵育1.5 h后，用ECL发光试剂盒进行化学发光，以Quantity One分析蛋白的光密度值，β-actin作为参照。

3 统计学处理

数据经SPSS 21.0软件分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 洋葱总黄酮提高过氧化氢作用下视网膜色素上皮ARPE-19细胞的活力

与control组比较，H2O2组的ARPE-19细胞活力显著降低；与H2O2组比较，FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞活力显著升高；FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞活力逐渐升高(P<0.05)，见表1。

表1 洋葱总黄酮处理对过氧化氢诱导的视网膜色素上皮ARPE-19细胞活力、凋亡和ROS生成的影响

Table 1.The effects of total flavonoids of onion (FO) on H2O2-induced cell viability, apoptosis and ROS production of retinal pigment epithelial ARPE-19 cells (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)Apoptosis (%)ROS (MFI)Control100.006.30±0.20215.42±26.45H2O232.58±5.51∗24.50±0.70∗608.97±30.68∗FO-L+H2O251.20±4.02∗△17.73±0.51∗△511.79±40.65∗△FO-M+H2O273.95±6.36∗△○13.03±0.90∗△○442.83±28.71∗△○FO-H+H2O285.24±7.13∗△○&10.70±0.36∗△○&305.28±30.19∗△○&

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2group;○P<0.05 vs FO-L+H2O2group;&P<0.05vsFO-M+H2O2group.

2 洋葱总黄酮减少过氧化氢作用下视网膜色素上皮ARPE-19细胞凋亡

与control组比较，H2O2组的细胞凋亡率升高；与H2O2组比较，FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞凋亡率降低；FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞凋亡率逐渐降低(P<0.05)，见图1和表1。

Figure 1.The images of flow cytometry for analyzing the effect of total flavonoids of onion (FO) on hydrogen peroxide (H2O2)-induced apoptosis of retinal pigment epithelial ARPE-19 cells.

图1 流式细胞术检测洋葱总黄酮处理对过氧化氢诱导的视网膜色素上皮ARPE-19细胞凋亡的影响

3 洋葱总黄酮减少过氧化氢作用下视网膜色素上皮ARPE-19细胞中ROS的生成

与control组比较，H2O2组的细胞中ROS水平升高；与H2O2组比较，FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞中ROS水平降低；FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞中ROS水平逐渐降低，见表1。

4 洋葱总黄酮减少过氧化氢作用下视网膜色素上皮ARPE-19细胞中MDA含量并提高SOD活性

与control组比较，H2O2组的细胞中MDA水平升高，SOD活性降低；与H2O2组比较，FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞中MDA水平降低，SOD活性升高；FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组的细胞中MDA水平逐渐降低，SOD活性逐渐升高，见表2。

表2 洋葱总黄酮处理对过氧化氢诱导的视网膜色素上皮ARPE-19细胞中SOD活性、MDA水平及线粒体膜电位的影响

Table 2.The effects of total flavonoids of onion (FO) on the levels of SOD, MDA and mitochondrial membrane potential in H2O2-induced retinal pigment epithelial ARPE-19 cells (Mean±SD.n=3)

GroupSOD (U/g)MDA (μmol/g)Mitochondrial membrane potentialControl56.62±4.201.54±0.134.36±0.10H2O230.15±2.16∗2.86±0.12∗2.03±0.12∗FO-L+H2O235.36±1.42∗△2.37±0.16∗△2.65±0.11∗△FO-M+H2O240.91±2.48∗△○2.07±0.10∗△○3.12±0.15∗△○FO-H+H2O246.12±3.21∗△○&1.81±0.12∗△○&3.74±0.21∗△○&

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2group;○P<0.05vsFO-L+H2O2group;&P<0.05vsFO-M+H2O2group.

5 洋葱总黄酮提高过氧化氢条件下视网膜色素上皮ARPE-19细胞线粒体膜电位并减少胞质中Cyt C的蛋白水平

与control组比较，H2O2组的细胞线粒体膜电位降低，胞质中Cyt C的蛋白水平升高；与H2O2组比较，FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组细胞质中Cyt C蛋白水平降低，线粒体膜电位升高；FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组细胞质中Cyt C蛋白水平逐渐降低，线粒体膜电位逐渐升高(P<0.05)，见图2、表2和表3。

Figure 2.The images of Western blot for determining the effects of total flavonoids of onion (FO) on the protein levels of Cyt C in the cytoplasm, and cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 in the retinal pigment epithelial ARPE-19 cells induced by H2O2.

图2 Western blot检测洋葱总黄酮处理对过氧化氢诱导的视网膜色素上皮ARPE-19细胞胞质中Cyt C及细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平的影响

6 洋葱总黄酮减少过氧化氢作用下视网膜色素上皮ARPE-19细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平

与control组比较，H2O2组细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平升高；与H2O2组比较，FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平降低；FO-L+H2O2组、FO-M+H2O2组和FO-H+H2O2组细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平逐渐降低(P<0.05),见图2、表3。

讨 论

视网膜色素上皮细胞损伤是常见眼底病发生的主要原因，生理状态下的视网膜色素上皮细胞是血-视网膜屏障的重要组成部分，对光感受器的更新及视色素合成等具有重要意义[7]。氧化损伤是视网膜色素上皮细胞功能障碍的主要原因，氧化应激能够抑制视网膜色素上皮细胞增殖活性，诱导细胞凋亡发生[8-10]。本实验用过氧化氢处理视网膜色素上皮细胞，细胞活力降低，细胞凋亡率升高，说明成功构建了视网膜色素上皮细胞氧化损伤模型。

表3 洋葱总黄酮处理对过氧化氢诱导的视网膜色素上皮ARPE-19细胞胞质中Cyt C及细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平影响

Table 3.The effects of total flavonoids of onion (FO) on the protein levels of Cyt C in the cytoplasm, and cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 in retinal pigment epithelial ARPE-19 cells induced by H2O2(Mean±SD.n=3)

GroupCyt C Cleaved caspase-3Cleaved caspase-9Control0.13±0.020.10±0.030.15±0.01H2O20.69±0.07∗0.39±0.05∗0.58±0.06∗FO-L+H2O20.51±0.04∗△0.31±0.02∗△0.41±0.03∗△FO-M+H2O20.36±0.06∗△○0.23±0.01∗△○0.30±0.04∗△○FO-H+H2O20.23±0.02∗△○&0.17±0.02∗△○&0.23±0.01∗△○&

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2group;○P<0.05vsFO-L+H2O2group;&P<0.05vsFO-M+H2O2group.

洋葱总黄酮是从洋葱中提取出来的活性成分，洋葱属于百合科草本植物，是一种家常蔬菜，洋葱具有降血压、防肿瘤和消炎等作用[11]。自然界中的大多数植物中均含有黄酮类化合物，并且多以苷类存在[12]。目前的研究显示，洋葱总黄酮对于视网膜损伤具有改善作用，其可以抑制视网膜组织中细胞凋亡发生，抑制视网膜组织中氧化应激反应[6]。本实验的结果表明，高中低剂量的洋葱总黄酮处理可以减少过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡，提高细胞的活力，洋葱总黄酮具有抗视网膜色素上皮细胞氧化应激的作用，洋葱总黄酮抗氧化应激作用可能具有浓度依赖性。

过往研究报道已经显示，氧化应激诱导细胞凋亡发生，其可以通过促进细胞中线粒体释放Cyt C诱导细胞中caspase凋亡反应的发生，而线粒体释放Cyt C与细胞线粒体膜电位下降有关[13-16]。caspase是一个与细胞凋亡有关的蛋白家族，其可以被胞质中的Cyt C激活，诱导细胞凋亡发生[17]。caspase-9是细胞凋亡的上游激活因子，其可以被释放至胞质中的Cyt C激活，从而诱导caspase级联反应的发生，最终激活下游效应因子caspase-3，诱导细胞凋亡发生[18]。氧化应激的发生与细胞内抗氧化系统障碍有关，抗氧化酶是抗氧化系统的重要组成部分，其活性降低可以诱导细胞内氧自由基积累[19]。生理状态下的氧自由基具有维持细胞氧化平衡和信号转导等作用，而病理状态下过量的氧自由基可以诱导细胞内脂质发生过氧化，生成大量的MDA[20]。SOD是氧自由基的清除剂，其活性降低可以直接诱导细胞中ROS积累，诱导氧化损伤[21]。本实验用洋葱总黄酮处理过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞，细胞中ROS水平降低，SOD活性升高，细胞合成的MDA含量下降，洋葱总黄酮可以抑制过氧化氢诱导的氧化损伤。同时本实验还显示，高中低剂量的洋葱总黄酮处理还可以提高视网膜色素上皮细胞线粒体膜电位，减少胞质中Cyt C积累，抑制细胞中caspase-3和caspase-9的活化，提示洋葱总黄酮可能能够呈浓度依赖性的通过ROS/Cyt C/caspase抑制过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞损伤。

总之，洋葱总黄酮具有抗视网膜色素上皮细胞氧化损伤的作用，其可以降低细胞氧化损伤，减少线粒体释放Cyt C，抑制caspase凋亡反应。本次实验结果证实在30、60和90 mg/L的洋葱总黄酮剂量范围内，其可以呈浓度依赖性的减轻氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤，本次实验只是初步探讨不同浓度的洋葱总黄酮的作用，在今后的实验中会考虑继续摸索“最佳剂量”，研究洋葱总黄酮的剂量效应。洋葱总黄酮可能是视网膜色素上皮细胞损伤相关疾病的治疗的潜在途径。