逍遥散对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损及抑郁神经递质的影响*

郭简宁， 王 燕， 赵京霞， 底婷婷， 张 璐， 李宁飞， 蒙玉娇， 郭昕炜， 刘正荣， 翟春艳， 刘 宇， 郭肖瑶， 齐 聪， 李 萍△

(1北京中医药大学， 北京 100029； 2首都医科大学附属北京中医医院， 北京市中医研究所， 银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室， 北京 100010)

银屑病是一种以角质形成细胞过度增殖和分化为特征，并具有遗传特性的炎症性皮肤疾病，在自然人群中的患病率为0.1%～3%[1]，近年来银屑病的发病率逐年升高。银屑病不仅是一种自身免疫性疾病，也是一种心身疾病，其临床典型表现为鳞屑性红斑或斑块，且皮损呈对称分布，精神变化、情绪紧张可加重病情。临床研究表明，银屑病患者具有抑郁、焦虑症的风险，且伴发的焦虑症往往与抑郁症并存[2]，这些潜在的精神疾病，可能使银屑病迁延不愈或恶化[3]。针对银屑病患者出现的精神心理问题，给予改善精神心理的药物、生物制剂和特殊心理疗法有一定的治疗作用[4-5]。

精神心理因素属于中医情志范畴，肝主情志，所以针对银屑病的心身疾病属性，各医家提出“从肝论治”银屑病，并取得了良好疗效[6-8]。逍遥散有疏肝解郁，养血健脾之功，在临床上可运用于治疗银屑病[9]，但其作用机制尚不明确。本实验采用咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型进行实验研究[10]，此种模型小鼠伴有一定情志状态改变[11]。故此，本项工作观察咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠是否伴随抑郁症状，从银屑病样皮损、行为学改变和抑郁症相关神经递质的含量变化角度，探究逍遥散的治疗效果，明确其可能的作用机制及靶点，为“从肝论治”银屑病提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 实验动物

36只SPF级雄性BALB/c小鼠，体质量18～20 g，6～8周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证编号为SCXK(京)2014-0013。动物实验获得北京中医医院动物伦理委员会的批准。

2 试剂、药物及仪器

2.1试剂和药物 逍遥散采购自北京同仁堂药店，药物组成为：柴胡、茯苓、白术、当归、白芍、甘草、生姜和薄荷。组方按照成人(60 kg)的剂量，根据人与动物间药物剂量换算比例换算成小鼠剂量[11]，按中药常规煎煮法制作成水煎剂，每日灌胃。另有甲氨蝶呤片(上海信谊药厂有限公司)、5%咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司)、DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)、3% (质量分数) H2O2去氧离子水及抗Ki67单克隆抗体和CD3单克隆抗体(eBioscience)；山羊血清工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；甲醇(色谱纯)和甲酸(色谱纯)均购于北京迪科马科技有限公司。

2.2仪器 徕卡全自动染色机、轮转切片机，Agilent 6410 QQQ LC-MS分析系统由Agilent 1290液相色谱仪及Agilent 6410 QQQ三重四极杆质谱检测器组成，Masshunter工作站。Hettich mzkro 220R台式低温高速离心机，Gene G560E涡旋式混匀仪[STUART SBH130D/3样品浓缩仪(氮吹仪)]。

3 方法

3.1动物造模、分组和给药 参考Fits等[10]的小鼠银屑病样模型制备方法造模。实验前戊巴比妥钠(80 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，背部备皮，面积约2 cm×3 cm，备皮后单笼饲养。依据随机数字表法，将小鼠随机分为空白对照(control)组、模型(model)组、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)组、逍遥散高、中、低剂量(Xiaoyaosang high, medium and low dose, XH、XM、XL)组，每组6只。空白对照组小鼠背部每日涂抹凡士林，余各组小鼠背部每日涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg；灌胃抹药前进行，每天 1 次，每次 0.2 mL，连续8 d：空白对照组与模型组给予0.2 mL 0.9% (质量分数)的氯化钠注射液，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤片溶液0.2 mL (1 mg/kg)，逍遥散高、中、低剂量组分别给予等量的不同浓度的中药药液，依次为7.58、3.79和1.89 kg/L。

3.2检测指标及方法

3.2.1一般状态的观察 每日观察各组小鼠的毛发色泽、精神状态、活动情况，以及舔舐梳理毛发次数。

3.2.2小鼠体重 造模前对各组小鼠体质量进行测量，造模第9天，取材前对其体质量进行测量，观察小鼠造模前后体重的变化。

3.2.3小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度评分(PASI评分) 每天对实验小鼠皮损进行拍照，根据PASI评分标准，采用双盲法评判各组小鼠皮损严重程度，即一实验人员将小鼠组别编号打乱，采用随机数字表法重新对小鼠编排新的序列号，找另一PASI评分经验丰富的实验人员对重新编号的小鼠评分，负责本实验的研究人员与PASI评分的实验人员对具体各组小鼠的PASI评分并不知晓。实验结束后对组别编号进行揭盲，统计分析数据，绘制PASI评分趋势图，动态观察小鼠皮损的变化情况。

3.2.4测量小鼠皮损表皮厚度 造模第9天，取小鼠背部皮肤固定于多聚甲醛中，脱水、包埋后制备5 μm石蜡切片。用苏木精-伊红(hematoxylineosin，HE)染色后在400倍光镜下拍片，每个标本选5张不同切片，在每张切片中随机测量5处表皮厚度，比较表皮层变化情况。

3.2.5小鼠皮损表皮层异常增生标志物Ki67的表达及CD3+T细胞浸润情况检测 制备5 μm石蜡切片，分别进行Ki67和CD3染色，使用免疫荧光法(immunofluorescence，IF)检测Ki67的表达，Ki67是一种增生细胞相关的核抗原，阳性细胞核呈绿色荧光，免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)检测CD3的表达。在400倍镜下，每例标本随机选取5个视野并拍照，应用IPP 6.0图像分析系统记录数据。

3.2.6糖水偏好实验 于造模第7天，进行糖水偏好实验。在实验前对各组小鼠禁食12 h，12 h后给予小鼠1瓶1 %的蔗糖水和1瓶纯净水，并称量两个水瓶的重量，将水瓶位置随机放置以防小鼠位置偏爱效应，让其自主选择饮水，1 h后分别称量两个水瓶的重量，计算出蔗糖水和纯净水的消耗量，根据公式：糖水偏爱率(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+纯净水的消耗量)×100%，计算出各组小鼠糖水偏爱率。

3.3小鼠海马、下丘脑组织样品处理 各组织样品称重，加入200 μL 0.1%甲酸-水匀浆，4 024 ×g、 4 ℃离心10 min，取上清液100 μL并加入0.1%甲酸-甲醇300 μL，混匀，15 493 ×g、 4 ℃离心10 min，取上清液350 μL氮气吹干，以50 μL 0.1%甲酸-水复溶，15 493 ×g、 4 ℃离心10 min，取上清液进样。

3.4液相条件 色谱柱：Waters AtlantisTMT 3(2.1 mm×100 mm, 3 μm)。流动相为水(0.1%甲酸)和甲醇。梯度洗脱：0 min，2%甲醇；0～3 min，2%～60%甲醇，3～5 min，60%～100%甲醇。流速为0.4 mL/min，进样量为5 μL，柱温30 ℃。

3.5质谱条件 ESI离子源，正离子检测方式，MRM模式。离子源条件为干燥气温度(Gas Temp)：300 ℃，干燥气流量(Gas Flow)：10 L/min，雾化器压力(Nebulizer)：45 psi，毛细管电压(Capillary)：4 000 V。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 6.0进行统计分析及作图。计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计量且正态分布资料相关性分析采用Pearson相关进行统计分析，非正态资料采用Spearman秩相关进行分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般状态的观察

造模前，各组小鼠的毛发整齐、色泽明亮，精神状态良好、好动；造模后观察发现，与空白对照组相比，模型组小鼠毛发凌乱、色泽枯黄，精神萎靡，舔舐梳理毛发次数较空白组减少；甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组小鼠较模型组小鼠上述情况有所缓解。

2 各组小鼠体质量变化

分别在造模前和取材前对各组小鼠体质量进行测量,见表1，计算各组小鼠造模前后体质量的变化，空白对照组小鼠体质量变化不明显，体质量变化幅度显著低于模型组(P<0.01)。此外，逍遥散高剂量组体质量变化幅度亦显著低于模型组(P<0.05)，见图1。

3 逍遥散对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损的影响

观察各组小鼠皮损变化，空白对照组小鼠皮肤白嫩光滑，无鳞屑、红斑和浸润现象；模型组于第2～3天开始出现轻微皮损，其背部皮肤鳞屑、红斑和浸润，随造模时间的延长不断加重，第8天皮损最严重，银白色鳞屑肥厚，表皮红肿，皮肤变硬变厚浸润明显，银屑病样皮损模型形成；与模型组同期相比，甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组皮肤鳞屑、红斑和浸润情况减轻，甲氨蝶呤组与逍遥散高剂量组小鼠皮肤鳞屑、红斑和浸润情况改善程度明显，见图2。

表1 各组小鼠造模前后体质量

Table 1.Body mass of mice in each group before and after mo-deling (g. Mean±SD.n=6)

Group Before animal modelingAfter animal modelingControl21.5±0.319.9±0.3Model22.1±0.318.4±0.6MTX22.0±0.319.2±0.5XH21.8±0.219.5±0.4XM21.8±0.319.1±0.4XL21.6±0.118.7±0.5

Figure 1.The body mass change of mice in each group before and after modeling. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

图1 各组小鼠造模前后体质量变化

Figure 2.Gross observation of mice at day 9 after modeling. A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

图2 各组小鼠于造模第9日时的皮损表现

制作PASI评分趋势图，空白对照组小鼠背部皮肤正常无改变，其鳞屑、红斑、浸润和总分分值始终为0；其余各组小鼠从造模第2天背部皮肤出现皮损起，其鳞屑、浸润、红斑和总分分值，随时间推移，不同程度的升高，于第8天达到峰值，模型组的鳞屑、浸润、红斑和总分分值最高；其中逍遥散高剂量组可显著降低浸润情况和总分分值(P<0.05),甲氨蝶呤组与逍遥散中、低剂量组评分较模型组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

Figure 3.PASI scoring trend chart of skin lesions in mice of each group. PASI: psoriasis area and severity index. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

图3 各组小鼠皮损PASI评分趋势图

4 HE染色观察各组小鼠皮损组织形态学变化

HE染色结果显示，空白对照组小鼠皮肤表皮层较薄，模型组较空白对照组表皮层明显增厚数倍，并可见明显的角化不全及角化过度、严重的炎症细胞浸润以及Munro微脓肿；甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组组织形态学变化相似，表皮层均比模型组薄，角化不全和角化过度减少，炎症细胞浸润程度减轻及Munro微脓肿减少，见图4。

Figure 4.Histomorphological changes of mice in each group after HE staining. A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

图4 各组小鼠皮肤HE染色后组织形态学改变

测量各组小鼠表皮垂直厚度，模型组表皮层厚度比空白对照组增厚4～5倍(P<0.01)；甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组表皮层厚度均较模型组减少(P<0.01)，见图5。

5 各组小鼠皮损中Ki67和CD3+T淋巴细胞表达情况检测

免疫荧光染色法观察各组小鼠皮损中Ki67表达情况，空白对照组小鼠Ki67表达于基底层细胞，见图6A；模型组小鼠Ki67在基底层和颗粒层均有表达，其阳性细胞数量较空白对照组显著增多(P<0.01)；甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组小鼠阳性细胞数量均较模型组显著减少(P<0.01)；逍遥散中剂量组阳性细胞数量显著少于甲氨蝶呤组(P<0.05)，见图6、表2。

Figure 5.Comparison of epidermal thickness between each group on day 9 after modeling. Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

图5 各组小鼠造模第9天时的表皮厚度比较

Figure 6.The expression of Ki67 in skin of mice in each group (IF). Blue: DAPI; Green: Alexa Fluor488. A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

图6 各组小鼠皮肤中Ki67的表达情况

表2 各组小鼠皮肤皮损中Ki67及CD3阳性细胞数量

Table 2.The number of Ki67 and CD3 positive cells in skin lesions of mice in each group (Number. Mean±SD.n=6)

GroupKi67CD3Control3.6±0.54.3±0.3Model65.3±3.0##22.40±1.6##MTX40.5±3.2##∗∗9.9±0.4##∗∗XH38.9±1.7##∗∗10.5±0.6##∗∗XM30.8±1.6##∗∗△10.6±0.6##∗∗XL41.7±1.6##∗∗10.1±0.5##∗∗

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel;△P<0.05vsMTX group.

免疫组织化学染色法观察各组小鼠皮损中真皮层CD3阳性T细胞浸润情况，空白对照组小鼠真皮层CD3阳性细胞数量较少，模型组小鼠较空白对照组CD3阳性细胞数量显著增多(P<0.01)，甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组小鼠皮肤组织中CD3阳性细胞数量显著少于模型组(P<0.01)，见图7、表2。

6 糖水偏好实验

糖水偏好实验结果显示，模型组小鼠糖水偏爱率显著低于空白对照组小鼠(P<0.01)，甲氨蝶呤组和逍遥散各剂量组小鼠糖水偏爱率较模型组小鼠有一定升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图8。

7 小鼠海马和下丘脑组织中多巴胺(dopamine,DA)、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid,HVA)和肾上腺素(adrenaline,AD)等神经递质含量的变化

液相色谱-质谱分析结果显示，与空白对照组相比，模型组海马区脑组织中DOPAC、谷氨酸(glutamate,Glu)、AD和γ-氨基丁酸(γ-aminobutylic acid,GABA)含量显著降低(P<0.05)，DA和HVA的含量无显著差异(P>0.05)；与空白对照组相比，甲氨蝶呤组海马区脑组织中DA、AD、DOPAC和GLU含量显著降低(P<0.05)，见表3。

与空白对照组小鼠相比，模型组下丘脑区脑组织AD和GABA的含量显著降低(P<0.05)，DA、DOPAC、HVA和GLU的含量无显著差异(P>0.05)；甲氨蝶呤组下丘脑区脑组织GABA含量明显低于空白对照组(P<0.01)，逍遥散高剂量组下丘脑区脑组织AD的含量较模型组显著增多(P<0.01)，逍遥散低剂量组下丘脑区脑组织HVA的含量较模型组显著增多(P<0.01)，见表4。

Figure 7.Expression of CD3 positive cells in the skin of mice in each group(IHC). A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

图7 各组小鼠皮肤中CD3阳性细胞表达情况

Figure 8.The sugar water preference rate of each group on the seventh day after modeling. Mean±SD.n=5.##P<0.01vscontrol group.

图8 造模第7天时各组小鼠的糖水偏好率

8 PASI评分与小鼠海马和下丘脑区脑组织中DA、DOPAC、HVA和AD等含量的相关性分析

DA、DOPAC、HVA和AD等计量资料均呈正态分布，采用双变量相关分析统计其各自与PASI评分的相关性，结果显示，PASI评分与海马区脑组织DOPAC、AD、GLU和GABA的含量呈负相关，与下丘脑区脑组织AD、GLU和GABA的含量也呈负相关，即PASI评分越高，小鼠背部皮损越重，抑郁相关神经递质表达量越低，表明小鼠抑郁程度越高。海马区脑组织DA、HVA含量，下丘脑区脑组织DA、DOPAC和HVA含量与PASI评分无相关性(P>0.05)，见图9、10。

表3 各组小鼠海马区脑组织神经递质含量

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

表4 各组小鼠下丘脑区脑组织神经递质含量

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

Figure 9.Scatter plot of the relationship between DA, DOPAC, HVA, AD, Glu, GABA and PASI score in the hippocampus.

图9 海马区脑组织DA、DOPAC、HVA、Glu、GABA和AD等神经递质含量与PASI评分关系散点图

讨 论

中医药在治疗银屑病等皮肤疾病中积累了丰富的临床经验，形成了完整的辨证论治体系，具有一定优势。中医认为银屑病属于情志疾病，与“心”、“肝”最为密切[12]，肝主疏泄，藏血，在体合筋,其华在爪；若肝失疏泄，气机不畅，久郁化火，热毒壅络，则发红斑，颜色鲜红，搔抓皮损有筛状出血；肝不藏血，血无法营养滋润腠理，所以有肌肤干燥脱屑、鳞屑叠起，瘙痒等症；肝血虚，爪甲不荣，而出现指甲顶针样改变[13]。银屑病迁延不愈，给患者造成心身打击，情志失调反过来亦可影响肝的生理功能，形成恶性循环。逍遥散源于宋《太平惠民和剂局方》，其药味配伍，既补肝体，又助肝用，气血兼顾，达到疏肝解郁、养血健脾之效，可针对银屑病肝失疏泄、肝血失养等病机。

实验结果显示，逍遥散可改善银屑病样小鼠皮损，降低PASI评分及表皮厚度，减少表皮细胞增殖，角化不全和T细胞浸润。此外通过小鼠一般状态、体质量变化和糖水偏好实验，观察小鼠抑郁状态，实验小鼠取材时间为第9天，空白对照组与模型组小鼠行为学结果产生差异后进行取材。糖水偏好实验是基于小鼠对甜味偏好这一特点，可评价实验动物抑郁样行为及抗抑郁药物治疗效果，当小鼠出现抑郁样行为时，其对糖水的偏嗜度也随之降低[14]。实验表明，逍遥散可提高小鼠糖水偏好率。除此之外，我们采用HPLC-MS技术，分析各组小鼠脑组织海马区和下丘脑区AD、GABA和GLU等反应抑郁程度的单胺类神经递质的含量。海马和下丘脑区是应激反应作用靶区，参与情绪反应，抑郁症相关研究多集中于这2个脑区。结果显示空白对照组神经递质含量显著高于模型组和甲氨蝶呤组，逍遥散可显著提高下丘脑区AD和HVA的含量，其余神经递质有一定升高趋势，但没有统计学差异。以上结果显示出此联系后，我们进一步研究了银屑病与抑郁相关神经递质的相关性分析，结果表明PASI评分与海马区DOPAC、AD、GLU和GABA的含量呈负相关，与下丘脑区AD、GLU和GABA的含量也呈负相关，即PASI评分越高，小鼠背部皮损越重，抑郁相关神经递质表达量越低，提示小鼠抑郁程度越高。

Figure 10.Scatter plot of the relationship between DA, DOPAC, HVA, AD, Glu, GABA and PASI score in the in hypothalamus.

图10 下丘脑区脑组织DA、DOPAC、HVA、Glu、GABA和AD等神经递质含量与PASI评分关系散点图

综上所述，逍遥散可有效缓解小鼠银屑病样皮损，在一定程度上可减轻其抑郁程度，银屑病发病机制与抑郁症相互作用靶点，还有待进一步探究。