一测多评法同时测定宁神定志丸中8种成分

许 伟

（东营市食品药品检验中心，山东 东营257091）

宁神定志丸收载于《卫生部颁药品标准（中药成方制剂第三册）》［1］，是由远志、党参、石菖蒲、茯苓4味药材加工而成的中成药复方制剂，具有益气安神、交通心肾、明目等功效，主要用于神志不宁、惊悸健忘、失眠，倦怠、视力减退等病症的治疗，疗效显著，但其现行质量标准仅对性状进行规定，未涉及成分定性鉴别或定量测定。

一测多评法通过测定复方制剂中对照品稳定、价格低廉的1种成分，利用中药成分之间存在的函数关系来实现多种成分同时测定，可有效降低检验成本，提高检测结果稳定性，广泛应用于中药材及中药制剂质量分析中。因此，本实验采用一测多评法，以3，6′-二芥子酰基蔗糖为内标，建立其与远志口山酮Ⅲ、党参炔苷、β-细辛醚、α-细辛醚、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸之间的相对校正因子，测定宁神定志丸中各成分含有量，以期验证所建立方法的可行性和准确性。

1 材料

Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；MS104TS 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-250DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。宁神定志丸（每袋9 g，批号170902、180201、180403）购自广西梧州制 药（集团）股份有限公司。远志口山酮Ⅲ（111850-201705，含有量96.5%）、3，6′-二芥子酰基蔗糖（111848-201604，含有量 96.7%）、党参炔苷（111732-201607，含有量 100.0%）、β-细辛醚（112018-201601，含有量96.8%）对照品购自中国食品药品检定研究院；α-细辛醚（2883-98-9，含有量98.0%）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司；去氢土莫酸（6754-16-1，含有量98.0%）、去氢茯苓酸（77012-31-8，含有量98.0%）对照品购自南京森贝伽生物科技有限公司；茯苓酸（29070-92-6，含量98.0%）对照品购自上海纯优生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05% 磷酸（B），梯度洗脱（0～13.0 min，21.0% A；13.0～29.0 min，21.0%～43.0% A；29.0～41.0 min，43.0%～72.0% A；41.0～52.0 min，72.0%～90.0% A；52.0～60.0 min，90.0%～21.0% A）；0～22.0 min 时在320 nm［2-3］波长下检测远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖，22.0～29.0 min 时在269 nm［4-5］波长下检测党参炔苷，29.0～41.0 min时在257 nm［6］波长下检测β-细辛醚、α-细辛醚，41.0～60.0 min 时在210 nm［7］波长下检测去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取各对照品适量，70%甲醇制成分别含远志口山酮Ⅲ1.538 mg／mL、3，6′-二芥子酰基蔗糖2.812 mg／mL、党参炔苷1.754 mg／mL、β-细辛醚4.332 mg／mL、α-细辛醚2.158 mg／mL、去氢土莫酸0.396 mg／mL、去氢茯苓酸0.318 mg／mL、茯苓酸0.482 mg／mL 的贮备液，各精密量取适量，70% 甲醇制备，即得（各成分质量浓度分别为76.9、140.6、87.7、433.2、107.9、19.8、15.9、24.1 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取丸剂适量研细，精密称取2.0 g，加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取45 min，放冷，70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照丸剂处方及工艺，分别制备缺远志、党参、石菖蒲、茯苓的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分与相邻色谱峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于3 500，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下贮备液各适量，70%甲醇分别制成25倍差的6个系列质量浓度线标溶液Ⅰ～Ⅵ，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样6次，测得远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖、党参炔苷、β-细辛醚、α-细辛醚、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积RSD 分别为0.89%、0.73%、0.77%、0.59%、0.65%、1.14%、1.19%、1.07%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重复性试验 取同一丸剂（批号170902），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖、党参炔苷、β-细辛醚、α-细辛醚、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸含有量RSD 分别为 1.11%、1.06%、1.10%、0.97%、1.02%、1.72%、1.83%、1.66%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号170902）的，室温下于0、2、4、6、12、16 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖、党参炔苷、β-细辛醚、α-细辛醚、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸峰面积RSD 分别为 0.85%、0.78%、0.83%、0.64%、0.71%、1.06%、1.15%、1.03%，表明溶液在16 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取含有量已知的丸剂（批号170902）适量，研成细粉，精密称取6份，每份约1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（远志口山酮Ⅲ0.849 mg／mL、3，6′-二芥子酰基蔗糖1.562 mg／mL、党参炔苷1.097 mg／mL、β-细辛醚4.619 mg／mL、α-细辛醚1.607 mg／mL、去氢土莫酸0.301 mg／mL、去氢茯苓酸0.192 mg／mL、茯苓酸0.368 mg／mL）各1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖、党参炔苷、β-细辛醚、α-细辛醚、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸平均加样回收率（RSD）分别为98.58%（1.17%）、99.46%（0.97%）、97.98%（1.30%）、100.04%（0.69%）、99.33%（0.59%）、97.66%（1.36%）、96.93%（1.44%）、97.84%（1.20%）。

2.4 相对校正因子计算 精密吸取“2.3.2”项下线标溶液Ⅰ～Ⅵ适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以3，6′-二芥子酰基蔗糖为内标，计算其他7种成分的相对校正因子，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，考察Waters 2695、LC-2010高效液相 色谱 仪，以 及Kromasil C18、Shim-pack C18、ODS-C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6 色谱峰定位 以3，6′-二芥子酰基蔗糖为内标，考察其他7种成分在“2.5”项色谱仪、色谱柱下的相对保留值，结果见表4，可知均无明显影响。

表4 各成分相对保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 样品含有量测定 取3批丸剂（批号为170902、180201、180403）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含有量，结果见表5，可知2种方法所得结果无明显差异，相对平均偏差（RAD）＜2%。

3 讨论

3.1 指标成分选择 宁神定志丸中远志为君药，主要含有皂苷、糖酯、口山酮，其中远志口山酮Ⅲ为口山酮类代表性成分，3，6′-二芥子酰基蔗糖为糖酯类代表性成分，具有良好的神经细胞保护、抗抑郁等作用；石菖蒲具有醒神益智、开窍豁痰、化湿开胃的功效，主要含有挥发油、黄酮、生物碱、氨基酸等成分，以β-细辛醚、α-细辛醚等挥发油为主；茯苓具有宁心、健脾、利水渗湿等功效，去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸等三萜是其主要药效成分；党参具有养血生津、健脾益肺的功效，党参炔苷为其代表性成分。因此，本实验选择上述8种成分作为指标成分。

表5 各成分含量测定结果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3.2 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了甲醇［4-9］、70%甲醇［2-3，10］、50%甲醇，发现以70%甲醇为提取溶剂时各成分的综合提取率最高；考察了超声提取［4-10］、回流提取［2-3］，发现两者提取效果差异不大，考虑到操作便捷性，故选择前者；考察了提取时间30 min［5，7，10］、45 min［6，8］、60 min［4］，发现提取45、60 min 时各成分提取率差异不大，但明显优于提取30 min。最终确定，供试品溶液制备方法为70%甲醇超声提取45 min。

3.3 流动相优化 本实验考察了乙腈-水［5，11］、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸［6，8］、乙腈-0.1%甲酸［4，12］、乙腈-0.1%磷酸［10］、乙腈-0.05% 磷酸［2-3，7，9，13-14］流动相系统，同时对其比例进行不断摸索。最终，选择乙腈-0.05%磷酸作为流动相，按“2.1”项下比例进行梯度洗脱。

3.4 成分含有量分析 宁神定志丸与其阴性样品中所测成分相对含有量存在一定差异，以β-细辛醚和α-细辛醚更明显，可能与药材所含成分在不同产地、采收期存在差异有关。因此，企业在生产时需关注原药材产地、采收季节等因素。

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定宁神定志丸中8种成分的含有量，该方法简便、准确、可靠，可有效降低检验成本，为完善提高该制剂质量标准提供全新的方法和依据。